脂质纳米颗粒（LNPs）作为RNA的临床先进递送系统，已在癌症治疗、蛋白质替代疗法、自身免疫性疾病治疗以及COVID-19等传染病的mRNA疫苗中展现出巨大潜力。然而，LNPs在递送过程中面临的一个主要生物学障碍是内体逃逸效率低，通常低于10%。尽管离子化脂质在酸性内体环境中能够促进膜融合，但天然存在的磷脂如DSPC和DOPE的功能尚未被充分理解，且很少有研究通过化学工程手段改善其功能性。本研究旨在设计一种新型两性离子磷脂，通过诱导立方相的形成，提高LNPs的内体逃逸效率，从而改善mRNA的功能性递送。

示意图

01
材料与方法

DOPE-Cx系列磷脂通过迈克尔加成反应合成。CL4F6作为一种pH敏感的阳离子脂质，用于构建LNPs。其他试剂如DSPC、DOPE、POPC、PEG-DMG等均购自商业供应商。

• LNPs的制备：采用微流控混合技术，将含有CL4F6、磷脂、胆固醇和PEG-DMG的乙醇溶液与含有mRNA的醋酸盐缓冲液混合，制备LNPs。通过透析和超滤步骤纯化LNPs。
• LNPs的表征：使用动态光散射（DLS）测量LNPs的粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位。通过核磁共振磷谱（31P NMR）和小角X射线散射（SAXS）分析脂质相行为。
• 体内实验：采用BALB/c小鼠模型，通过尾静脉注射LNPs，评估mRNA在肝脏中的表达水平。使用生物发光成像系统（IVIS）监测LNPs在体内的分布

Figure 1. Strategy and structure of DOPE-Cx.

02
结果与讨论

体内mRNA表达水平评估：为了评估DOPE-Cx磷脂对mRNA递送效率的影响，我们制备了含有不同磷脂（DSPC、DOPE、以及一系列DOPE-Cx变体）的脂质纳米颗粒（LNPs），并通过尾静脉注射到BALB/c小鼠体内。6小时后，收集小鼠肝脏组织，通过荧光素酶（Fluc）活性检测来评估mRNA的表达水平。

• DSPC与DOPE对照组：与含有DSPC的LNPs相比，含有DOPE的LNPs并未显著提高mRNA的表达水平，这表明单纯替换DSPC为DOPE并不能有效改善mRNA的递送效率。
• DOPE-Cx变体：引人注目的是，含有DOPE-Cx变体（特别是DOPE-C6、C8和C10）的LNPs显著提高了mRNA在肝脏中的表达水平。其中，DOPE-C8表现出最高的mRNA表达水平，相较于DSPC对照组，其Fluc活性提高了数倍。
• 链长依赖性：进一步的研究发现，DOPE-Cx磷脂的疏水链长度对mRNA表达水平有显著影响。较短的疏水链（如C4和C6）和较长的疏水链（如C12和C18:1）均未能达到与DOPE-C8相当的表达水平，表明存在一个最佳的疏水链长度范围。

Figure 2. Impact that the chemical structure of DOPE-Cx exerts on the hepatic delivery of mRNA.

EGFP表达验证：为了验证mRNA序列的独立性，我们还制备了含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码mRNA的LNPs，并观察了其在肝脏组织中的表达情况。与Fluc表达结果一致，含有DOPE-C8的LNPs显著诱导了EGFP在肝脏中的表达，进一步证实了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA递送效率方面的有效性。

细胞类型鉴定：通过免疫荧光染色，我们发现mRNA主要在肝细胞中表达，这表明DOPE-Cx磷脂能够有效地将mRNA递送至目标细胞类型。

³¹P NMR分析：为了深入理解DOPE-Cx磷脂如何影响LNPs的脂质相行为，我们采用了31P核磁共振（NMR）技术。将DOPE-Cx磷脂与磷脂酰胆碱（POPC）以不同摩尔比混合，并制备成脂质悬浮液进行NMR分析。

• 层状相与非层状相：纯DOPE在与POPC混合时，迅速从六方相（H相）转变为层状相（L相）。然而，DOPE-Cx磷脂在与POPC混合时，能够诱导形成非层状立方相（Q相），这在NMR谱图中表现为在0 ppm处出现尖锐的峰。
• 链长与相行为：进一步的分析表明，DOPE-Cx磷脂的疏水链长度对其诱导立方相的能力有显著影响。较短的疏水链（如C4至C8）更有利于立方相的形成，而较长的疏水链则倾向于形成六方相。

Figure 3. Analysis of the lipid phase of DOPE-Cx lipid mixed with POPC.

SAXS与Cryo-TEM验证：为了进一步验证DOPE-Cx磷脂诱导立方相的形成，我们采用了小角X射线散射（SAXS）和冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）技术。

• SAXS分析：SAXS谱图显示，含有DOPE-C8和POPC的脂质悬浮液在低角度区域出现了特征性的立方相散射峰，进一步证实了立方相的存在。
• Cryo-TEM观察：Cryo-TEM图像清晰地展示了含有DOPE-C8和POPC的脂质纳米颗粒内部存在有序的立方相结构，这与NMR和SAXS的分析结果一致。

为了评估DOPE-Cx磷脂在体内的代谢情况，我们采用了液相色谱-质谱联用（LC/MS）技术。在注射含有DOPE-C8的LNPs后不同时间点收集小鼠肝脏组织，并测定DOPE-C8的浓度。结果显示，DOPE-C8在肝脏中的浓度迅速下降，半衰期较短（约1.83小时），表明其不易在体内积累。此外，通过血清稳定性实验发现，DOPE-C8在血清中容易被酯酶降解，生成无毒的代谢产物。

这些详细的实验结果充分证明了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA递送效率方面的有效性，并展示了其在体内的安全性和良好的代谢特性。

Figure 4. Characterization of DOPE-C8-LNPs.

03
结论

本研究成功设计并合成了一种新型立方相诱导的两性离子磷脂DOPE-Cx，通过诱导立方相的形成，显著提高了LNPs在肝脏中的mRNA递送效率。此外，DOPE-Cx在体内表现出良好的安全性和代谢特性，为mRNA治疗应用提供了新的策略。未来的研究将进一步探索DOPE-Cx在其他组织中的递送效率，并优化其化学结构以提高功能性。