疫苗是抵御病原体感染的有力武器，能够激发适应性免疫的疫苗尤为重要。核酸疫苗，包括mRNA疫苗和DNA疫苗，因其独特优势在近年来备受关注。mRNA疫苗在COVID-19预防中表现出色，如Moderna的SpikeVax和Pfizer-BioNTech的Comirnaty已获批使用。然而，mRNA疫苗在生产和储存方面存在挑战，如需要冷链运输。DNA疫苗则具有临床安全性高、稳定性好且生产简单的优点，但裸DNA免疫原性较差。近期，美国费城wistar研究所疫苗和免疫治疗中心David B. Weiner团队在Cell Reports Medicine发表名为“Modulation of lipid nanoparticle-formulated plasmid DNA drives innate immune activation promoting adaptive immunity”的研究。本研究旨在探索脂质纳米颗粒包裹的质粒DNA（DNA-LNP）疫苗，以期发挥其优势，克服现有问题。

示意图

结果
实验结果详细描述

研究制备了不同N/P比例（10.5、5.3、2.6）的CA09血凝素（HA）表达质粒DNA-LNP（HA DNA-LNP），并考察了其生物物理特性和免疫原性。表征显示，10.5和5.3 N/P比例的DNA-LNP具有相似的封装效率（分别为91%和89%），而2.6 N/P比例的封装效率略低，接近80%。2.6 N/P比例的DNA-LNP颗粒较大，zeta电位更低。免疫小鼠后，发现10.5和5.3 N/P比例的DNA-LNP能显著提高总生发中心（GC）B细胞的频率，而2.6 N/P比例则显著降低。尽管如此，所有N/P比例的DNA-LNP均能诱导相似的激活T滤泡辅助细胞（Tfh）反应和抗原特异性CD4+及CD8+ T细胞反应。

透射电子显微镜（TEM）结果显示DNA-LNP和mRNA-LNP在形态上相似。体内成像显示，Luciferase DNA-LNP在注射后40天内持续表达于肌肉中，而Luciferase mRNA-LNP信号在表达后迅速减弱至基线水平，且在肝脏中短暂表达。

局部促炎细胞因子产生：免疫后4小时和24小时，与PBS对照组相比，HA DNA-LNP和HA mRNA-LNP均显著上调了多种促炎细胞因子，如IFNγ和IL-6。mRNA-LNP在4小时时诱导了较高的IP-10上调，而DNA-LNP在24小时时IP-10水平与之相当。

DNA感知通路的机制研究：使用化学抑制剂阻断cGAS-STING-TBK1通路后，DNA-LNP诱导的IFNα和IFNγ分泌显著减少，而阻断TLR9通路则无此效果。这表明cGAS-STING通路是DNA-LNP诱导炎症反应的主要驱动因素。

Figure 1. Initial immune characterization of HA DNA-LNP formulations and immunogenicity

免疫细胞亚群的变化：免疫后24小时，与mRNA-LNP和佐剂蛋白相比，DNA-LNP显著增加了迁移性树突状细胞（mDCs）在引流淋巴结（DLNs）中的频率，特别是CD103+ mDCs。同时，DNA-LNP还显著增加了中性粒细胞的频率，而mRNA-LNP则增加了单核细胞的频率。

免疫细胞激活状态：DNA-LNP免疫诱导了所有髓系细胞亚群的激活，特别是mDCs和CD103+ mDCs的CD86表达显著增加。在脾脏中，DNA-LNP免疫也诱导了类似的髓系细胞激活模式，但mDCs频率保持相对稳定。

cGAS-STING依赖性验证：在STING敲除小鼠中，DNA-LNP诱导的髓系细胞频率和激活状态显著降低，表明这些反应依赖于cGAS-STING通路。

Figure 2. Early immune profiling of innate and adaptive populations reveals STING-dependent activation status after HA DNA-LNP immunization

CD8+ T细胞反应：HA DNA-LNP诱导的IFNγ分泌CD8+ T细胞反应显著高于mRNA-LNP和佐剂蛋白组，分别高出3倍和7倍。在低剂量（0.2 mg）下，HA DNA-LNP诱导的CD8+ T细胞反应与高剂量（2 mg）的mRNA-LNP相当，显示出显著的剂量节省效应。

CD4+ T细胞反应：HA DNA-LNP和mRNA-LNP诱导的IFNγ分泌CD4+ T细胞反应相当，且显著高于佐剂蛋白组。然而，所有组诱导的IL-2分泌CD4+ T细胞反应相似。

Figure 3. HA DNA-LNP elicits potent antigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses

GC反应：尽管HA DNA-LNP诱导的GC Tfh细胞频率有所下降，但GC B细胞的绝对数量与mRNA-LNP组相当。HA DNA-LNP诱导的抗原特异性GC B细胞反应在频率和绝对数量上均低于mRNA-LNP组。

血清抗体反应：HA DNA-LNP诱导的血清IgG反应与mRNA-LNP和佐剂蛋白组相当，且抗体滴度持久存在至少24周。对相关流感病毒株的抗体结合和血凝抑制（HAI）滴度也稳定存在24周。

Figure 4. HA DNA-LNP induces robust GC and serum responses

小鼠T细胞记忆反应：免疫后一年，HA DNA-LNP诱导的IFNγ分泌细胞反应比mRNA-LNP或佐剂蛋白组高约4倍。效应记忆CD8+ T细胞反应也显著高于其他组。

小鼠B细胞记忆反应：HA DNA-LNP诱导的骨髓驻留浆细胞反应与mRNA-LNP和佐剂蛋白组相当。抗原特异性记忆B细胞反应在HA DNA-LNP和mRNA-LNP组中相似，且显著高于佐剂蛋白组。

兔子T细胞反应：在兔子模型中，相同剂量下，HA DNA-LNP诱导的IFNγ分泌细胞反应在免疫后42天时比HA mRNA-LNP强约2倍，且在202天内仍能维持较高水平的反应。

兔子体液免疫反应：HA DNA-LNP和mRNA-LNP诱导的血清IgG反应相当，且对不同流感病毒株的HAI滴度也相似。尽管HA mRNA-LNP组的IgG反应有所减弱，但HA DNA-LNP组的反应保持稳定。

Figure 5. HA DNA-LNP induces potent memory responses in mice and rabbits

抗体反应：编码SARS-CoV-2刺突蛋白的DNA-LNP和mRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导了相似的抗原特异性总IgG反应，对RBD和不同变异株的刺突蛋白均产生竞争性的抗体反应。

中和滴度：Spike DNA-LNP诱导的中和滴度与Spike mRNA-LNP相当。

保护效力：在小鼠攻毒实验中，Spike DNA-LNP和mRNA-LNP均能保护小鼠免受致死性SARS-CoV-2攻击，体重无明显下降且全部存活，而空载体对照组小鼠则出现体重下降和高死亡率。

Figure 6. SARS-CoV-2 spike DNA-LNP elicits serum antibody responses and is protective in lethal challenge

结论

本研究描述了一种脂质纳米颗粒包裹的质粒DNA（DNA-LNP）制剂，该制剂能够诱导强大的先天免疫和适应性免疫反应，其血清学效力与mRNA-LNP和佐剂蛋白疫苗相当。通过使用编码流感血凝素（HA）的构建体，研究发现HA DNA-LNP免疫能够通过刺激干扰素基因刺激因子（STING）依赖的方式上调并激活迁移性树突状细胞（DC）亚群。与mRNA-LNP或佐剂蛋白相比，HA DNA-LNP诱导了更优越的抗原特异性CD8+ T细胞反应，且记忆反应可持续超过一年。在兔子模型中，相同剂量下，HA DNA-LNP的免疫反应与mRNA-LNP相当或更优。此外，编码SARS-CoV-2刺突蛋白的DNA-LNP在小鼠模型中显示出与刺突mRNA-LNP相当的保护效力。本研究揭示了DNA-LNP平台特有的启动机制，为预防性和治疗性疫苗的开发提供了新途径。