“随着mRNA技术的快速发展，mRNA基治疗药物在多种疾病的治疗中展现出巨大潜力。然而，目前mRNA-LNPs的给药方式主要依赖于液体形式，如使用雾化器或高压气体将其雾化后给药。这种方式存在气道刺激、稳定性差等局限性。因此，开发mRNA-LNPs的粉末制剂具有重要意义。喷雾冻干技术作为一种无热制备粉末的方法，在药物制剂领域得到广泛应用。本研究通过pH调节的喷雾冻干技术，成功制备了适合吸入的mRNA-LNPs粉末，并对其理化性质、转染效率及体内外功能进行了评估。”

mRNA/LNP在不同冻干保护剂和缓冲液条件下冻干前后的包封率变化

02
实验结果

2.1 粉末制备与表征：

本研究采用pH调节的SFD技术成功制备了mRNA-LNPs吸入性粉末。通过调节溶液在SFD过程中的pH值，增强了mRNA与LNPs中可电离脂质之间的相互作用，从而保留了封装结构。制备的粉末呈现出适合吸入的特性，mRNA在SFD后仍然被封装在LNPs内。

表一、处方组成

表二、喷雾干燥后LNP重新水花后的理化性质表征

2.2 理化性质分析

• 粒径与电位：使用ZetaSizer Nano对重新水合的mRNA-LNPs进行粒径测定，结果显示，尽管SFD后mRNA-LNPs的粒径有所增加，但仍在可接受的范围内（约100-150nm），且未观察到明显聚集。Zeta电位测定也证实了粉末的稳定性。
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• 封装效率与mRNA完整性：通过电泳分析评估了mRNA的完整性，结果显示，在pH 3和5条件下进行SFD时，大部分mRNA仍然保留在LNPs内部，且mRNA未发生降解。同时，测定了mRNA的封装效率，发现pH调节后的SFD方法提高了封装效率。
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• 形态观察：使用透射电子显微镜（TEM）观察了原始液态和粉末状mRNA-LNPs的形态，结果显示，粉末状mRNA-LNPs在重新水合后保持了良好的形态结构。

图二、喷雾干燥后LNP的表征

图三、喷雾干燥后LNP重新水化的形态表征

2.3 生物活性评估

• 细胞表达活性：将制备的粉末状mRNA-LNPs分散在培养基中，并添加到A549和RPMI 2650细胞中，评估其蛋白表达活性。结果显示，在pH 5条件下制备的粉末状mRNA-LNPs在两种细胞中均表现出最高的Luc（荧光素酶）表达水平。此外，ZsGreen1（一种绿色荧光蛋白）的表达也呈现出类似的趋势。
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• 细胞内分布与摄取：使用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLMS）评估了粉末状mRNA-LNPs在细胞内的分布和摄取情况。结果显示，尽管在pH 5条件下制备的粉末状mRNA-LNPs的细胞内摄取量不是最高的，但其蛋白表达水平却是最高的。这表明，pH调节可能增强了mRNA向LNPs的封装效率，而不是直接促进了细胞内摄取。
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• 长期储存稳定性：评估了粉末状mRNA-LNPs在长期储存后的稳定性。结果显示，在pH 5条件下制备的粉末状mRNA-LNPs在储存105天后仍然保持了较高的蛋白表达水平，而未进行pH调节的粉末状mRNA-LNPs在储存105天后蛋白表达水平几乎无法检测到。此外，与原始液态mRNA-LNPs相比，粉末状mRNA-LNPs在储存62天后表现出更高的mRNA转染效率。
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• 气管内给药效果：将粉末状和液态mRNA-LNPs气管内给予小鼠，并评估了其在肺部的蛋白表达水平。结果显示，与液态mRNA-LNPs相比，粉末状mRNA-LNPs在小鼠肺部表现出较低的蛋白表达水平，但仍然具有显著的生物活性。这表明，粉末状mRNA-LNPs可能适用于吸入性给药。

图五、喷雾干燥后LNP的体外表达表征

图六、喷雾干燥后LNP的稳定性表征

03
结论

本研究成功采用pH调节的SFD技术制备了mRNA-LNPs吸入性粉末，并发现该粉末具有良好的理化性质和生物活性。特别是在pH 5条件下制备的粉末状mRNA-LNPs表现出较高的蛋白表达水平和长期储存稳定性。本研究为mRNA-LNPs的吸入性给药提供了新的思路和方法，有望为呼吸系统疾病和黏膜疫苗的治疗提供新的解决方案。

参考文献：Ogawa, Koki, et al. "Stable and inhalable powder formulation of mRNA-LNPs using pH-modified spray-freeze drying." International Journal of Pharmaceutics 665 (2024): 124632.