400-021-7882

还原响应型RNAi纳米平台重组肿瘤脂质代谢和复极化巨噬细胞用于胰腺癌联合治疗

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发表时间:2023-03-23 14:43作者:微米



简介

胰腺癌(PAC)是最致命的恶性肿瘤之一,总体5年的生存率不到10%。2020年,全球报告了495,773例新的PAC病例和466,003例死亡。目前,PAC的标准治疗方法是手术切除,然后辅以吉西他滨或卡培他滨进行化疗。不幸的是,由于缺乏早期症状,大约80%-90%的PAC患者被诊断为晚期,失去了手术切除的机会。对于这些患者,通常使用化疗药物(如吉西他滨和卡培他滨)来提高他们的存活率。然而,严重的全身毒性和迅速发展的耐药性严重制约了治疗效果。因此,迫切需要制定更有效的治疗晚期PAC的策略。


新的证据表明,代谢改变显著促进了癌症的发展和进展。近年来,脂代谢异常已被认为是促进肿瘤发生发展的一种新的显著代谢改变。在肿瘤微环境(TME)下,脂类可被分解成游离脂肪酸(FFAs),然后通过脂肪酸氧化(FAO)生成ATP,作为形成生物膜的重要组成部分,并被用作合成肿瘤细胞信号转导分子。在这一生物过程中,单酰基甘油脂肪酶(MGLL)是一种在肿瘤细胞中高效表达的脂解酶,它通过将三酰甘油(TG)的代谢中间产物水解成游离脂肪酸,在调节三酰基甘油(TG)代谢过程中发挥关键作用。因此,阻断MGLL活性可能会抑制游离脂肪酸的产生,从而抑制肿瘤细胞的营养供应。然而,MGLL阻断可同时诱导肿瘤细胞中2-花生四烯酸甘油(2-AG)的积聚,这些2-AG可以分泌到TME中,并通过激活TAM中过度表达的内源性大麻素受体-2(CB-2)的活性,促进肿瘤相关巨噬细胞( TAMs )向促肿瘤M2样表型转化。因此,同时阻断肿瘤细胞的MGLL活性和抑制TAMs上CB-2的表达可被认为是有效的PAC治疗的有效策略。近年来,RNA干扰(RNAi)技术取得了重大突破,几种RNAi疗法已获准临床应用。作为RNAi技术的效应分子,小干扰RNA(SiRNA)可以沉默任何靶基因的表达,包括那些编码不可成药的蛋白质。纳米颗粒(NPs)已被证明是系统性siRNA递送的有力工具。特别是,由于实体肿瘤表现出与正常组织不同的微环境,生物响应性纳米颗粒可以被合理地设计来增强siRNA在肿瘤组织中的扩散,肿瘤细胞对siRNA的摄取,和/或细胞内siRNA的释放,从而导致更好的抗癌效果。因此,NPs介导的RNAi技术可能成为同时阻断MGLL活性和抑制CB-2表达的有效工具。


在此,我们收集了12例PAC患者的手术切除肿瘤,鉴定MGLL和CB-2分别在PAC细胞和TAM上的高表达。基于这一特定的表达谱和生物响应NPs在系统性递送siRNA方面的优势,我们进一步构建了系统共同递送MGLL siRNA(siMGLL)和CB-2 siRNA(siCB-2)的还原响应型NP平台和有效的PAC治疗(Scheme1)。该还原响应型NP平台由固体聚二硫酰胺(PDSA)/阳离子脂核和脂质-聚乙二醇壳(Lipid-PEG)组成。该纳米平台包裹siRNA后,静脉给药后,血液循环时间长,在肿瘤组织中蓄积较高。在被PAC细胞和TAMs摄取后,细胞质中的高浓度谷胱甘肽(GSH)可以诱导细胞内快速释放siRNA,有效地抑制MGLL和CB-2的表达,从而抑制PAC细胞中FFAs的产生,并使TAMs从促进肿瘤的M2样表型复极化为抑制肿瘤的M1样表型。同时抑制FFAs的产生和TAMs的复极化,通过还原响应型NPs系统递送siMGLL和siCB-2可以显著抑制异种移植瘤和原位肿瘤模型中PAC的生长。


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Scheme1.用于联合治疗PAC的还原响应型RNAi纳米平台的示意图。


结果与讨论

PAC患者肿瘤组织中MGLL和CB-2表达的检测


为了检测MGLL和CB-2在PAC中的表达,特别是其准确的定位,我们收集了12例PAC患者的手术切除肿瘤(n=12),并用免疫组织化学法(IHC)检测了MGLL和CB-2在肿瘤及癌旁组织中的表达。如图1a所示,MGLL主要在所有PAC患者的肿瘤组织中表达。CB-2在肿瘤组织中的表达也远高于癌旁组织(图1B)。这一结果得到了来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库的数据分析的进一步支持。如图1C所示,MGLL和CB-2在PAC患者肿瘤组织中的表达(n=182)明显高于癌旁组织(n=167)。此外,MGLL的高表达与PAC患者较差的OS(图1D)和DFS(图1E)相关。以上结果提示选择MGLL和CB-2作为PAC治疗靶点的可行性。


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图1. (A, B) PAC患者癌旁组织和肿瘤组织中MGLL(A)和CB-2(B)表达的IHC分析(n=12)。(C) TCGA数据库显示MGLL和CB-2在PAC患者癌旁(n=171)和肿瘤组织(n=179)中的表达。(D)TCGA数据库显示MGLL高表达和低表达的PAC患者(n=167)的OS。(E) TCGA数据库,显示高表达和低表达MGLL的PAC患者的DFS(n=159)。


在证实了MGLL和CB-2在PAC中的高表达后,我们进一步选择了6例PAC手术切除的肿瘤,并用免疫荧光(IF)法检测了MGLL和CB-2在肿瘤组织中的定位。如图2a所示,通过用一种特定的标记物上皮细胞黏附分子(EpCAM)标记PAC细胞,红色荧光染色的MGLL主要在PAC细胞中表达。CB-2仅在使用CD68抗体用绿色荧光标记的TAM上表达(图2B)。


为了进一步验证这一结果,使用CM诱导的原代TAMs和PAC细胞株来检测MGLL和CB-2的表达。从蛋白质印迹分析(Western blot)的结果(图2C和D)来看,MGLL只在来源于人(ASPC-1和PANC-3)和小鼠(LTPA)的PAC细胞中表达,而CB-2只在TAMs中表达。基于这种特定的表达情况,通过NPs系统递送siMGLL和siCB-2的同时有望对肿瘤脂质代谢进行重新编辑,并将TAMs从促进肿瘤的M2样表型复极化为抑制肿瘤的M1样表型,从而实现联合PAC治疗。TAMS已被证明可以竞争性地内化肿瘤内的NP治疗药物从而减少其被肿瘤细胞摄取,因此,简单地将siMGLL和siCB-2共同包裹到一个RNAi纳米平台中可能会将这一弱点转变为优势,因为它们被PAC细胞和TAMS摄取,可分别用于沉默PAC细胞中MGLL的表达和TAMS中CB-2的表达。


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图2. (A, B) PAC病人肿瘤组织中MGLL (A)和CB-2 (B)的表达。(C, D) MGLL和CB-2在人源(C)和鼠源(D) PAC细胞系和原始TAMs中的表达。


设计还原响应RNAi纳米粒用于体外MGLL和CB-2沉默


在证明了MGLL和CB-2在PAC中高效和特异性的表达后,我们接下来构建了RNAi NPs来沉默它们的表达。在这项工作中,我们以前开发的还原响应NPs被用来同时包裹siMGL1和siCB-2,因为它们特别有利于系统地递送生物大分子,与细胞外液(约2-10μM)相比,这些生物大分子在细胞质中需要更高的GSH浓度(约2-10 mM)才能发挥作用。该NP平台由DSPE-PEG3k、还原响应型PDSA聚合物和两亲性阳离子脂质G0-C14组成(图3A)。如图3B和C所示,将siRNA(siMG11/siCB-2,摩尔比为1:1)的水溶液与PDSA聚合物、DSPE-PEG3k和G0-C14的DMF混合物混合,然后添加到去离子水中快速搅拌,可以形成平均尺寸为~110 nm、zeta电位为−5.17 mV的球形NPs(记为NPs(siMG11/CB-2))。在冻干NPs的FT-IR光谱中,PDSA聚合物中的酯键(~1740 cm−1)、PDSA聚合物和G0-C14中的酰胺键(~1650和1530 cm−1)以及PDSA聚合物和DSPE-PEG3k的甲基和亚甲基(~2920和2850 cm−1)的吸光度表明,在负载siRNA的NPs中存在PDSA聚合物、DSPE-PEG3k和G0-C14。此外,新制备的纳米粒子的核磁共振谱中聚乙二醇链的强烈信号表明,PDSA聚合物、G0-C14、DSPE-PEG3k和siRNA的共同组装结构确实可以使负载siRNA的纳米粒子具有亲水性的聚乙二醇外壳和疏水性的PDSA核心。用荧光染料FAM和Cy5分别标记siMGLL和siCB-2,测得siMGLL和CB-2的包封率均为80%。此外,这些siRNA纳米粒在含有低浓度谷胱甘肽(如10μM和1 mM)或10%胎牛血清的PBS溶液中表现出良好的稳定性。然而,高浓度的GSH(如10mM)可以诱导NP解离,从而迅速释放包裹的siRNA,表明还原反应良好。


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图3. (A)siRNA递送和基因沉默的还原响应NPs示意图。(B, C) NPs(siMGLL/siCB-2)在水溶液中的TEM图像(B)和粒径分布(C)。(D, E) 用不同剂量的siRNA处理LTPA细胞(siMGLL/siCB-2),用qRT-PCR(D)和Western印迹(E)分析检测MGLL的表达。(F, H)对照NPs、NPs(siCB-2/sinc)、NPs(siMGLL/sinc)或NPs(siMGLL/siCB-2)处理的LTPA细胞的相对游离脂肪酸水平(F)、增殖曲线(G)和集落形成实验(H)。


在成功制备NPs(siMG11/CB-2)并验证其还原响应之后,我们接下来研究了这些携带siRNA的NPs是否能够有效地沉默MGLL和CB-2的表达。如图3D和E所示,与负载对照siRNA的还原响应NPs相比,NPs (siMGLL/CB-2)确实可以下调LTPA细胞中MGLL的表达,其沉默效率与siMGLL剂量呈依赖关系。值得注意的是,由于缺乏CB-2的表达,用对照siRNA(记为NPs(siMGLL/sinc))取代siCB-2并不影响它们沉默MGLL表达并抑制FFA的产生的能力(图3F)。在细胞增殖图谱(图3g)和集落形成试验(图3h)中也可以看到类似的结果。当MGLL沉默以抑制游离脂肪酸的产生时,NPs(siMGLL/CB-2)和NPs(siMGLL/sinc)显示出相似的可以抑制LTPA细胞增殖和集落形成的能力。


为了研究CB-2沉默是否会导致巨噬细胞表型的复极化,我们用免疫组化方法检测了巨噬细胞中CD206(M2样巨噬细胞标志物)和肿瘤坏死因子α (M1样巨噬细胞标志物)在TAMs中的表达。如图4C所示,用NPs (siMG11/siCB-2)或NPs (siCB-2/sinc)沉默CB-2后,CD206可以诱导TAM从M2样表型向M1样表型的复极化。为了进一步证明这一结果,还用qRT-PCR检测了其他经典的M1和M2样表型标记的表达。如图4D所示,沉默TAMs中CB-2的表达后,M2样巨噬细胞的经典标志物CD206、CCL-22和Arg-1的表达显著降低。相反,M1型巨噬细胞的经典标志物CD80、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶的表达显著增加,有力地证明了TAMs成功地从M2样表型复极化到M1样表型。更重要的是,由于这种表型转换可以诱导肿瘤杀伤细胞因子的分泌,如肿瘤坏死因子-α和IL-12,与沉默PAC细胞中MGLL的表达相结合,可能达到联合抗癌的效果。如图4F所示,无论是NPs(siMGLL/sinc)单独抑制LTPA细胞中FFAs的生成还是NPs(siCB-2/sinc)对TAMs的单一复极化都可以诱导细胞凋亡。这一结果证明了将siMGLL和siCB-2包裹在一个纳米平台上,通过同时抑制FFA的产生和TAMs的复极化为类M1表型可以达到预期的联合抗癌效果。


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图4. (A, B)通过qRT-PCR(A)和Western印迹(B)分析测定不同siRNA剂量的NPs(siMG11/siCB-2)处理的原代TAM中CB-2的表达。(C)分析对照NPs、NPs(siCB-2/sinc)、NPs(siMGL1/sinc)或NPs(siMGL1/siCB-2)处理的原代TAM中CD206和肿瘤坏死因子-α的表达。(D)用(C)所示公式处理的原代TAM进行定量RT-α分析,检测M2样巨噬细胞(CD206、CCl-22和Arg-1)和M1样巨噬细胞(CD80、肿瘤坏死因子-iNOS和iNOS)的经典标志物的表达。(E)在Boyden小室装置中与原代TAMs和携带siRNA的NPs共培养的LTPA细胞的示意图。(F)流式细胞仪分析与原代TAMs和(C)所示公式共同培养的LTPA细胞的凋亡。


体内MGLL和CB-2沉默


我们接下来评估了NPs (siMGLL/siCB-2)在体内同时沉默MGLL和CB-2表达的能力。如图5A所示,与快速从血液中清除的裸露siRNA相比,将siRNA包裹到NPs中可以显著延长其血液循环时间。这种延长的血液循环主要是由于聚乙二醇外层的保护。携带Cy5-siRNA的纳米粒通过静脉注射到LTPA异种移植瘤小鼠体内来检测BioD。如图5B和C所示,负载siRNA的NPs在肿瘤组织中的积聚比裸露的siRNA多8倍以上。在确认还原响应NPs能够延长血液循环和增强包裹的siRNA的肿瘤聚集后,我们接下来将NPs (siMGLL/siCB-2)静脉注射到LTPA异种移植瘤小鼠中,以检测它们在体内的基因沉默效果。如图5D-F所示,连续注射三次后,NPs (siMGLL/siCB-2)可同时下调MGLL和CB-2的表达约60%,肿瘤组织中FFA的产生显著被抑制~50%(图5G),因为肿瘤组织中CD206表达的减少(图5H)和肿瘤坏死因子-α的表达增加(图5I),可以推断肿瘤内TAM也可以从促进肿瘤的M2样表型复极化为抑制肿瘤的M1样表型。


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图5. (A)裸露的siRNA和负载siRNA的NPs的血液循环概况。(B) LTPA移植瘤小鼠肿瘤和主要器官的重叠荧光图像。(C)从(B)中量化的裸露siRNA和携带siRNA的NPs的生物分布。(D-G) NPs、NPs (siCB-2/sinc)、NPs (siMGLL/sinc)和NPs(siMGLL/siCB-2)处理的LTPA移植瘤小鼠肿瘤组织中MGLL和CB-2的表达的蛋白印迹测定(D-F)和相对游离脂肪酸水平(G)测定。(H,I)分析(D)所示公式处理的LTPA移植瘤小鼠肿瘤组织中CD206(H)和肿瘤坏死因子-α(I)的表达。


异种移植的抑制与原位肿瘤生长


在验证了体内有效的基因沉默的基础上,我们最终研究了NPs (siMGLL/siCB-2)抑制PAC肿瘤生长的能力。为此,将NPs (siMGLL/siCB-2)静脉注射到LTPA异种移植瘤小鼠体内,每隔2天注射一次,每只小鼠注射1nmolsiRNA剂量(n=8)。如图6A-C所示,连续注射四次后,与NPs (siMGLL/sinc)或NPs(siCB-2/sinc)处理的小鼠相比,NPs (siMGLL/siCB-2)显示出最强的抗癌作用。通过沉默MGLL的表达来抑制FFAs的产生,以及通过沉默CB-2的表达来使TAMs复极化到类M1表型,可以达到联合PAC治疗的目的,IHC分析进一步证明了这一点。如图6D所示,肿瘤组织的TUNEL和Ki67染色表明,与其他配方相比,NPs (siMGLL/siCB-2)在诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖方面最有效。


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图6. (A,B) PBS、对照NPs、NPs(siCB-2/sinc)、NPs(siMGLL/sinc)和NPs(siMGLL/siCB-2)处理的LTPA移植瘤小鼠的肿瘤大小(A)和重量(B)。(C)每组在终点(第24天)收集的LTPA异种移植瘤的照片。(D)系统治疗后各组LTPA移植瘤组织的TUNEL和Ki67染色。


为了进一步验证NPs (siMGLL/siCB-2)的联合抗癌作用,我们通过将表达荧光素酶(Luc)的LTPA细胞注射到小鼠胰腺建立了原位肿瘤模型(图7A和B),然后将NPs (siMGLL/siCB-2)以每只小鼠1nmol siRNA的剂量静脉注射给原位荷瘤小鼠 (n=5)。通过使用生物发光成像检测肿瘤组织的平均辐射来监测肿瘤生长(图7C)。如图7D-G所示,同时抑制FFA产生和TAMS的复极化为类M1表型,NPs (siMGLL/siCB-2)具有最强的减轻原位肿瘤负荷的能力。与异种移植瘤的IHC分析结果(图6D)相似,NPs (siMGLL/siCB-2)显示出最强的诱导细胞凋亡和抑制增殖的能力。


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图7.(A,B)一只有代表性的LTPA原位荷瘤小鼠的照片(A)及其原位肿瘤的组织学切片。(C)用PBS、对照NPs、NPs (siCB-2/sinc)、NPs (siMGLL/sinc)和NPs (siMGLL/siCB-2)治疗LTPA原位荷瘤小鼠的示意图。(D)第0、7、14天LTPA原位荷瘤小鼠的生物发光图像。(E)通过生物发光成像在第0、7和14天测定肿瘤负荷的平均辐射强度。(F, G) 终点(第14天)各组收集的LTPA原位肿瘤的照片(F)和重量(G)。


结论

这种纳米平台显示出长时间的血液循环和高肿瘤聚集等优点。在被PAC细胞和TAMS内化后,该NP平台会对细胞质中高浓度的GSH做出反应,迅速释放siMGLL和siCB-2,从而高效地沉默MGLL和CB-2,抑制PAC细胞中FFAs的产生,诱导TAMs复极化为肿瘤抑制的M1样表型。通过抑制FFAs的产生来抑制肿瘤细胞的营养供应,并使TAM复极化以分泌杀瘤细胞因子,还原响应型RNAi纳米平台可以显著抑制异种移植瘤和原位肿瘤模型中PAC的生长。在这项工作中开发的RNAi纳米平台显示了PAC治疗的巨大潜力。


文章来源:Cao Shuwen. et, al. Reduction-responsive RNAi nanoplatform to reprogram tumor lipid metabolism and repolarize macrophage for combination pancreatic cancer therapy. Biomaterials, 2022, 280, 121264.

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