1. 喷雾给药后CPPs的细胞渗透效率
不同的CPPs在植物细胞中表现出不同的转运水平。荧光素四甲基罗丹明（TAMRA）标记的CPPs，如两性的BP100、阳离子非两性的赖氨酸/组氨酸（KH9）和非两性的精氨酸（R9）及其d构型（dR9），在注射浸润后对各种植物细胞表现出中等至较高的渗透效率。此外，人工设计的含有周期性α-氨基异丁酸（Aib）的CPPs，如KAibA（Ala）、KAibG（Gly）和KAibK，在植物和动物细胞中显示出明显改善的细胞穿透能力和稳定性。为了测试这些CPPs在喷洒时的细胞渗透效率，我们将含有0.1 μg/ml的CPPs溶液喷洒到拟南芥（拟南芥生态型Col-0）的叶片上，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）比较喷洒后不同时间点植物细胞中的TAMRA荧光（图1a）。CPPs的细胞渗透效率指的是TAMRA-CPPs的不同荧光强度，即在喷洒后被吸附并转运到叶细胞中。喷洒后，14.8-29.1%的TAMRA标记的CPPs到达植物叶片的表面。在喷洒了TAMRA标记的BP100、KH9、R9和dR9的植物中，叶片正面（上部）的表皮细胞的荧光逐渐增加（图1b, c）。然而，TAMRA标记的人工CPPs KAibA、KAibG和KAibK对这些细胞的渗透效率较低（图1b、c）。我们还观察到喷洒了TAMRA标记的KH9、R9和dR9的叶片的护卫细胞有强烈的TAMRA荧光，这表明这些阳离子CPPs被动地通过气孔渗入叶片，并高度聚集在气孔下腔中（图1a-c）。与其他被检查的CPPs相比，TAMRA标记的dR9表现出更高的腭裂中叶的渗透效率。（图1d，e）
2. 核酸/CPP复合物的转染效率
图2 将质粒DNA/CPP复合体喷洒后转染到植物细胞中
我们将不同的BP100衍生的阳离子CPPs和Cy3标记的pBI221形成复合物。将所得复合物的溶液喷洒到过量表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因拟南芥植物的叶片上，并在喷洒后2小时通过CLSM检查Cy3标记的pBI221在叶细胞中的荧光（图2a）。与只喷洒了Cy3标记的pBI221和Cy3标记的pBI221/BP100复合物的叶片相比，在喷洒了四个Cy3标记的pBI221/BP100衍生的阳离子CPP复合物的表皮细胞中，观察到Cy3荧光信号明显增强 (2- 5倍) (图2b)。这些Cy3标记的pBI221/阳离子CPP复合物进入转染的细胞并定位到细胞质中（图2c-l）。然后我们分析了不同的Cy3标记的pBI221/阳离子CPP复合物在大豆和番茄叶细胞中的转染效率。与拟南芥叶细胞中的结果一致，所有四个Cy3标记的pBI221/阳离子CPP复合物在喷洒后在大豆叶细胞中显示出明显高于Cy3标记的pBI221仅或Cy3标记的pBI221/BP100复合物的转染效率（图2m）。在番茄叶细胞中，只有KH9-BP100在喷洒后表现出较高的质粒DNA分子转染效率（图2n）。在BP100的任何一端或两端添加生物分子结合域都会影响其细胞穿透能力以及接合生物分子的相互功能。在以前的研究中，KH9-BP100比R9-BP100在注射器浸润后表现出更高的DNA分子转染植物细胞的效率。目前的结果表明，在所有四个阳离子结构域融合的BP100 CPPs中，N端融合的KH9-BP100为通过叶面喷洒将外源DNA分子运输到植物细胞提供了最有效的工具。此外，我们在不同组织中对荧光蛋白高表达的拟南芥和番茄的Cy3荧光成像表明，KH9-BP100在促进生物大分子载体的长距离运输和稳定Cy3-质粒DNA分子的同时，在喷洒后从叶片转运到其他植物组织中具有辅助作用。然而，KH9-BP100在喷洒后有效地将生物分子输送到植物中的相当大的输送能力会受到叶片特征的影响，如气孔密度、毛细血管的外观和叶片结构的差异。此外，细胞外角质层成分的复杂性和叶细胞的细胞壁成分的硬度可以关键性地决定不同植物物种中叶面应用的生物分子/CPP复合物的转染效率。3. 叶面喷洒质粒DNA/CPP复合物在植物细胞中进行转基因表达
图3 基于细胞穿透肽的DNA载体在叶面施用后对植物细胞的吸收效率
为了验证基于多肽的叶面喷洒技术在植物细胞中的基因传递效率，我们以不同的N/P比率生成了β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因表达载体pBI221与高效CPP KH9-BP100的质粒DNA/CPP复合物（图3a）。水溶液中pBI221/KH9-BP100复合物的流体动力学直径从190nm逐渐下降到79nm，而所形成的复合物的表面电荷在增加N/P比率时逐渐增加。在不同的N/P比率下，增加KH9-BP100的添加量以形成pBI221/KH9-BP100复合物，复合物溶液的pH值略有下降。质粒DNA分子在pBI221/KH9-BP100复合物溶液中在静电场中的移动性随着N/P比的增加而逐渐下降。在N/P比=2.0时形成的pBI221/KH9-BP100复合物的AFM成像显示了完整的、单分散的球形复合物。根据不同N/P比形成的质粒DNA/CPP复合物的理化性质和形态外观，我们选择在N/P比=2.0时形成的pBI221/KH9-BP100复合物溶液进行喷雾应用。Silwet L-77和其他农业表面活性剂通过破坏复杂的角质蜡层和植物叶片的第一层表皮，以及诱导气孔吸收外来分子，促进生物分子和纳米结构在多变的叶片表面的运输。将经Silwet L-77稀释的质粒DNA/CPP复合物喷洒到拟南芥和大豆叶片上，可显著增强转染后叶片细胞的GUS活性(图3b−e)。DNA/CPP复合物在大豆叶片中的转染效率远远低于拟南芥(图3b,d)。拟南芥和大豆可能在细胞表面组成、细胞对外来分子的反应、纳米颗粒摄取机制或转基因表达机制方面存在差异。4. 喷洒siRNA/CPP复合物诱导植物细胞基因沉默
图4 可喷涂多肽-siRNA对植物细胞基因表达的抑制作用
使用RNA干扰（RNAi）技术对植物重要性状进行工程化处理有很多益处，因为这种方法可以非转基因的方式完成。以前用高压喷雾法将游离的双链小干扰RNA（siRNA）分子应用于植物细胞，成功地抑制了目标mRNA分子的水平。此外，最近的研究表明，将小RNA分子与纳米载体如CPP17、三维（3-D）DNA纳米结构和碳纳米管相结合，提高了基因沉默效率和RNA分子浸润后在植物细胞中的稳定性。因此，我们开发了一种高通量的喷雾应用技术，将siRNA/CPP复合物引入植物细胞，以实现高效的基因敲除（图4a）。我们合成了27bp的siGFPS1 RNA双链，这对沉默转染植物细胞中GFP变体（GFP、增强型GFP[eGFP]和黄色荧光蛋白[YFP]）的表达有潜在的优越活性。双链的siGFPS1 RNA分子与KH9-BP100复合物形成264nm的带负电荷的siRNA/CPP复合物，N/P比=2.0。这些球状的siRNA/CPP复合物显示了预期的siRNA分子在静电场中的凝胶阻滞模式。为了测试siGFPS1在植物细胞中的基因沉默活性，我们将含有siRNA/CPP复合物的溶液喷洒到过表达YFP的转基因拟南芥叶片上。将siGFPS1/KH9-BP100复合物溶液喷施于过表达YFP的植株上，显著降低了植物细胞中YFP的荧光(图4b、c)，并导致喷施后3天叶片中YFP蛋白水平下降45.5%(图4d、e) (DAS)。此外，我们观察到在3 DAS后，喷洒siRNA/CPP复合物的转基因拟南芥叶片中YFP转录水平下降了54.1% (图4f)。这些结果表明，叶面喷施后siGFPS1/KH9-BP100复合物能有效诱导植物细胞的转基因沉默。
5. 喷雾应用生物大分子传递到叶绿体
图5 通过基于多肽的叶面喷洒将质粒DNA和siRNA分子靶向递送至叶绿体
基于纳米粒子的定向生物分子传递到质体（包括叶绿体）是一种不断发展的质体工程的生物技术工具。在叶片浸润后，质粒DNA在叶绿体内被特异性释放，这一过程由基于CTP/CPP的簇状DNA递送系统和单壁碳纳米管介导。利用表面修饰的镉基纳米粒子，生物活性化合物可以选择性地转运到叶绿体中，以微调植物细胞的氧化状态。这些技术为操纵植物细胞的细胞器功能提供了可行的基于纳米粒子的平台。为了研究基于CTP/CPP的生物大分子通过喷洒进入质体的效率，我们产生了质粒DNA与CTP KH9-OEP34和CPP BP100在N/P比=1.0时的簇状复合物，这些质粒DNA携带有叶绿体特异的Renilla荧光素酶（Rluc）表达盒pPpsbA::Rluc。将得到的复合体在喷洒液（5%蔗糖+0.05%Silwet L-77）中，通过喷洒的方式施用于拟南芥叶片，并在喷洒后72小时内测量叶片中的Rluc活性（图5a）。与喷洒仅含有质粒DNA分子或N/P比值=1.0时形成的质粒DNA/CTP复合物的叶片相比，喷洒后24-72小时，质粒DNA/CTP复合物在拟南芥叶片中的转染效率逐渐提高（最高为7.6倍，平均为2.7倍）（图5b）。这些结果表明，使用基于肽的叶面喷洒，核酸分子可以有效地定向到叶绿体。由多肽载体运送到叶绿体的siGFPS1 dsRNA分子可能解离成单链反义RNA，随后与目标eGFP转录本形成RNA双链。这些反义的siGFPS1/eGFP RNA双链随后被叶绿体RNase III内切酶裂解，导致eGFP转录本的丰度降低，eGFP在叶绿体中的积累减少（图5c-g）。在DNA复制和转录启动过程中，解离的反义siGFPS1链也能与解开的转质体中eGFP基因的互补DNA序列结合。最后，反义siGFPS1/eGFP DNA异源双链在解决R环复制体的碰撞和启动转质体中高转录的eGFP表达盒的转录中抑制了质体RNase H1的内切酶活性。一个有效的方案来改善一个特定的具有经济意义的代谢途径，导致植物中个别的代谢物的合成，需要多种可控调节剂的综合组合，以完全控制共存于不同细胞区的分叉反应。例如，生物合成的异戊烯基二磷酸酯的生物合成，是异戊烯类最终产品的核心中间体，在植物中有两条不同的途径，一条是细胞膜上的甲戊酸（MVA）生物合成途径，另一条是质体上的磷酸甲硫醇（MEP）途径。具有吸引力的是，这两种不同途径中的限速酶的催化活动可以被外源性的生物大分子调控或生化损害。这两条不同的途径中的催化活动可以被外源性的生物分子所调节或生化损害。功能性肽基载体具有以下能力：（1）识别不同的生物大分子和化合物；（2）有效地将输送的货物运入植物细胞；（3）选择性地将指定的分子输送到特定的细胞区，特别是线粒体和质体。然而，复杂的细胞渗透/细胞器靶向肽的序列工程和大规模生产，以及优化生物大分子/肽复合物的生理外观，有可能使我们基于肽的喷洒技术的生物技术功能最大化。此外，设计一个由无人机技术、物联网（IoT）和这种喷雾技术组成的综合平台，可以实现有效的智能耕作和精准农业。
