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聚乙烯亚胺-环糊精纳米粒用于siRNA和DOX的共递送

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发表时间：2022-06-06 09:21作者：迈安纳




简介


癌症仍然是世界上主要和突出的死亡原因，在过去的几十年里，越来越多的实验疗法专注于癌症治疗。化疗是治疗癌症的一种有效方法。然而，由于肿瘤的高度复杂性和分子异质性，单一的治疗方法不足以抑制癌症的进展。使用特定药物和基因的联合治疗成为了一种治疗恶性肿瘤的有利方法，以较低的剂量给予化疗药物，然后减少副作用和提高疗效。还可以降低抗药性和癌症复发的风险。阿霉素(Dox)是一种破坏DNA的化疗药物，已被用于治疗多种恶性肿瘤。这种药物通过抑制拓扑异构酶II和抑制DNA复制而显示出高度的细胞毒作用，从而诱导细胞凋亡、抗增殖和抑制肿瘤血管生成。此外，拓扑异构酶的过度表达是Dox高毒性和非选择性靶向的一个重要因素。因此，如果与其他癌症治疗方法联合使用以减少剂量和其他多种副作用和风险，则该药物的毒性可以降低。人端粒酶逆转录酶(HTERT)是人端粒酶促进肿瘤细胞增殖和侵袭的主要亚基。因此，靶向端粒酶逆转录酶是预防和治疗端粒酶依赖性肿瘤的一种潜在策略。小干扰RNA(SiRNA)可用于实现癌基因调控因子表达的特定基因沉默，HTERT siRNA可以抑制癌症的进展。尽管具有巨大的潜力，但杂乱无章的siRNA片段会被内源性酶迅速降解，并且由于其高度亲水性和多阴离子特性而几乎不能穿过细胞膜。因此，通过促进细胞摄取来克服这些限制对siRNA递送至关重要。最近，几个纳米颗粒平台已经被建立为高效的非病毒siRNA载体。在各种纳米载体中，环糊精(CD)被认为是一种很有前途的基于寡核苷酸的治疗的天然聚合物。此外，CD修饰的聚阳离子表现出很好的生物相容性，并且可以直接与治疗性核酸形成稳定的聚合物。这些修饰的聚阳离子还具有两亲性，当核酸分子凝聚在结构中时，可以有效地促进纳米结构的形成。基于CD的主客体超分子纳米组装结构由于其简单的自组装方式和合适的结合类似物的结合能力而能够有效地包裹药物并控制其释放。这种相互作用可以用来偶联具有低载药量和低包封率的纳米粒的功能部分。



Scheme 1. roFPC/Ad-Dox HGSNPs的形成示意图和roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs复合体的概念示意图


合理设计添加叶酸的氧化还原敏感递送载体可以通过阻止高分子阳离子聚合物的积累来减少对细胞的毒性，并通过受控的细胞内释放和细胞膜上FRS的有效循环来提高转基因效率。因此，本研究开发了氧化还原敏感folate-appended-polyethylenimine-β-cyclodextrin (RoFPC) 主客体超分子纳米粒(HGSNPs)，用于靶向联合递送Dox和HTERT siRNA到乳腺癌细胞系(MDAMB-231、MCF-7)以及标准细胞系MCF-10（Scheme1）。将β-CD与支化的PEI (MW600(bPEI-600))进行交联，以降低细胞毒性并保持当前对纳米载体的细胞转染率。然后，将PEI-βCD(PC)星形阳离子聚合物用叶酸通过氧化还原敏感的共价二硫键修饰成rFPC，然后将客体金刚烷偶联阿霉素(Ad-Dox)与宿主roFPC组装成rFPC/Ad-Dox HGSNPs。HTERT siRNA通过带正电荷的PEI-600片段与带负电荷的hTERT siRNA之间的静电作用而结合，得到药物和基因共递送的roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs复合体。该共递送载体结合了Dox增强型基因转染、良好的水溶性和生物相容性的抗肿瘤特性，具有显著增强的血液相容性，并特别针对仅在低N/P水平的叶酸受体阳性细胞，以促进有效的细胞凋亡用于癌症治疗。


（1）RoFPC/Ad-Dox HGSNPs表征


如图1所示，通过核磁共振氢谱证明中间体和最终聚合物的合成成功。


图1.A.DMSO-d6中Dox、Ad-COOH、Ad-Dox、PC、FPC/Ad-Dox和roFPC/Ad-Dox的核磁共振氢谱。B.RoFPC/Ad-Dox的ESI-MS分析。C.在D2O中1：2(主客体)的Ad-Dox和roFPC混合物的2D-NOESY核磁共振波谱。


（2）RoFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的表征


开发siRNA分布载体的一个重要要求是与游离siRNA形成稳定的络合物的能力。聚合物-siRNA复合体(多聚体)被浓缩为胶体NPs，用于细胞内化。HTERT siRNA可以通过静电作用与阳离子载体结合。用凝胶电泳法检测roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的基因结合能力。如图3A所示，随着N/P比的增加，游离siRNA在第一通道显示出主要的迁移率，而条带迁移率和强度逐渐降低(通道2-7，图2A)。在所有通道中，siRNA的浓度保持不变。当N/P比达到16：1时，siRNA完全集中在hGSNPs的表面，可以作为后续实验的合适N/P比。在N/P比为16：1的最后一条通道上涂抹10 mM的GSH，以测定roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs表面二硫键的断裂。



图2 A.琼脂糖凝胶电泳法分别在N/P比为1：1、2：1、4：1、8：1、16：1的情况下对roFPC/Ad-Dox/siRNA进行琼脂糖凝胶电泳。B.以16：1的N/P比从roFPC/Ad-Dox/siRNA中释放siRNA。将制备的纳米载体与不同水平的GSH孵育24 h，进行琼脂糖凝胶电泳。C.roFPC/Ad-Dox(A)和roFPC/Ad-Dox/siRNA(B)的透射电子显微镜成像，N/P=16，siRNA=100 nm。D.不同N/P比形成的roFPC/Ad-Dox/siRNA的颗粒大小和Zeta电位。E.roFPC/Ad-Dox(A)和roFPC/Ad-Dox/siRNA(B)的DLS，N/P=16，siRNA=100 nM。


结果表明，在roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs中，通过还原剂断裂氧化还原触发的二硫键，嵌入的siRNA可以从表面释放出来，并且siRNA条带的强度得到了改善。在琼脂糖凝胶电泳系统上，以N/P比16：1，在不同水平的GSH存在下，对roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs进行siRNA释放试验(图2B)。如图2B所示，当GSH水平增加时，带的迁移率和强度成比例地增加。透射电子显微镜成像还证明，当暴露于GSH时，roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs结构崩塌，随后发生显著的形态变化，表明GSH引发了roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的分解。


此外，载药hGSNPs的电位和颗粒大小如图2C，D所示。当比例大于8时，hGSNPs显示正电荷和均匀的颗粒尺寸。透射电子显微镜显示，roFPC/Ad-Dox HGSNPs呈球形，典型尺寸为150 nm，而凝聚的roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs更致密、更小。有效地将siRNA压实成颗粒尺寸在100 nm左右的小hGSNPs，有利于细胞内化。DLS也证实了hGSNPs的大小变化和均匀分布(图2e)。研究表明，直径为100-200 nm的聚合物纳米粒子在防止吞噬吸收方面具有最好的性能，而直径为300 nm的纳米粒子也非常适合细胞摄取和一般运输。这些结果表明，roFPC/Ad-Dox可以与siRNA形成具有良好颗粒大小和正电荷的siRNA缩合物，有利于细胞内吞。


（3）溶血实验



图3.A.rFPC在31.2 5-10 0 0 μg/mL浓度范围内的红细胞溶血百分率。B不同N/P比(16、25、30、35)的roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的溶血百分率。


图3A显示载体浓度达500μg/mL时，溶血率仍低于5%，几乎没有浓度依赖的溶血效应。图3B显示HGSNPS在pH=7.4时表现出与阴性对照相似的溶血活性（<5%），表明其具有良好的生物相容性。当N/P比为16时，HGSNPs显示出与空白值相当的血红蛋白释放(<5%)。正如先前的一项研究所表明的那样，roFPC的低细胞毒性可能与其多聚体的低电荷密度有关。在N/P=16时，roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的Zeta电位小于+20 mV(图2D)。低电荷密度的roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs可以减少细胞膜的破坏和红细胞血红蛋白的释放。







细胞凋亡


图4为固定浓度的siRNA ( 100 n M )和Dox ( 0.5μg / m L )处理组的结果。从游离Dox处理组到roFPC / Ad-Dox / siRNA处理组，两细胞株的细胞凋亡率均呈递增趋势。hTERT mRNA的沉默会影响正常的细胞活动，这解释了为什么hTERT siRNA转染导致肿瘤细胞快速凋亡和细胞存活率下降。纳米复合体在HepG2细胞中诱导hTERT基因的显著沉默、细胞生长抑制和主要细胞凋亡。与游离Dox组、PC/Ad-Dox组和PC/siRNA组相比，PC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs中化学药物和基因药物的有效协同作用诱导了两种细胞的高度显著的凋亡。这种非常高的细胞凋亡率归因于有效的靶向递送和与MCF-7细胞相比，MDA-MB-231细胞对化学药物和基因药物的摄取要高得多。




图4.A，8B。流式细胞仪检测细胞凋亡率：MDA-MB-231、MCF-7及各处理组细胞



细胞摄取试验


检测rFPC/Ad-Dox/siRNAHGSNPs (N/ P = 16, siRNA = 100 nM, Dox = 0.5 μg/ mL)在三种细胞系中的摄取效率，并与正常的MCF-10A细胞进行比较。在细胞摄取实验中，通过固有的Dox荧光(红色)检测到细胞内的信号，并用绿色荧光标记FAM标记的siRNA。培养4h后，在MDA-MB-231和MCF-7细胞中，与非靶向HGSNPs孵育的细胞相比，经roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs孵育的细胞显示出更强的Dox(红色)和siRNA(绿色)荧光强度。此外，如图5A，B所示，MDA-MB-231细胞对roFPC/Ad-Dox/siRNA的摄取比MCF-7细胞高得多。与MCF-7细胞相比，MDA-MB-231细胞具有更多的表面FRs，因此更高比例的FR靶向HGSNP通过受体介导的内吞作用被摄取，从而导致更高的细胞摄取。有趣的是，FR靶向HGSNPs的高细胞内化只发生在过度表达FRS的癌细胞中，而不是在细胞表面FRS表达较低的健康细胞中。当细胞与游离FA和roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs同时孵育时，细胞对roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的摄取受到影响和抑制。因为游离FA能与roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs竞争，降低细胞对roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNPs的摄取，显示FA对HGSNPs具有特异性的肿瘤靶向性。这一观察结果表明，靶向配体与药物递送载体的交联可以显著提高药物递送的潜力，并在癌症治疗中有效地靶向肿瘤。此外，对阳性(siRNAFAM和Dox)细胞的定量流式细胞术测量也显示了类似的结果(图5E)。靶向HGSNPs比非靶向HGSNPs和游离Dox更有效地将siRNA和Dox转运到细胞内。此外，siRNA和Dox-荧光细胞在低倍共聚焦图像中的分布相似，与它们的荧光强度的差异无关，而在高倍共聚焦图像中，它们在细胞质中的分布相似。


图5 A. 细胞摄取





结论


综上所述，我们将化疗药物的主客体相互作用和siRNA缩合的静电相互作用相结合，制备了具有刺激响应性的roFPC/Ad-Dox/siRNA HGSNP。以一种简单的方法制备roFPC/Ad-Dox超分子复合体，然后将hTERT siRNA缩合成具有合适颗粒大小和表面正电荷的水溶性复合体，从而在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞上协同递送药物和基因，即可构建HGSNPs。在FR介导的内吞作用后，由于共递送系统中可还原的二硫键连接，FA基团从载体上分离，导致结合的FRs释放，随后FRs从细胞质循环到细胞膜表面，促使FR持续介导的内吞作用实现增强的基因转染。此外，roFPC的主客体结构允许持续的pH依赖的细胞内药物释放，以及同步和有效的基因转染。有效的hTERT siRNA转染在hTERT mRNA和蛋白表达水平上均有较强的基因抑制作用，导致主要癌细胞的凋亡，同时提高了Dox的治疗效果。因此，hGSNP可能成为未来癌症治疗的潜在共递送载体。


文章来源：Mousazadeh Hanieh. Stimulus-responsive drug/gene delivery system based on polyethylenimine cyclodextrin nanoparticles for potential cancer therapy. Carbohydrate polymers, 2022, 276, 118747.



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