黏附性纳米粒递送KDM6A-mRNA可抑制膀胱癌的转移

Kdm6a (也称为UTX)基因编码组蛋白去甲基酶，称为赖氨酸特异性去甲基酶6A(KDM6A)，它是一种重要的表观遗传调节因子。KDM6A作为肿瘤抑制因子在膀胱癌(BCA)中的作用已被广泛认识。由于KDM6A的缺失会增加BCA的风险和突变，KDM6A的表达降低不仅可以预测BCA患者的不良预后，还可能表明KDM6A在BCA的肿瘤发生中发挥关键作用。外源KDM6A通过Kdm6a-DNA在不同的Kdm6细胞中重新表达，导致细胞生长和增殖率下降。然而，它的失活和再激活在BCA转移中的功能后果仍然很大程度上尚不清楚。考虑到肌肉侵袭性(MI)BCA(即T2至T4期)有转移到淋巴结或其他器官的机会，清楚地了解KDM6A状态与BCA转移之间的关系的功能后果可能指导未来BCA的机制和翻译研究。然而，由于各种障碍，Kdm6a缺失的BCA中KDM6A的水平仍然难以在原位有效上调，以直接验证其抑制BCA转移的治疗潜力。

目前，据我们所知，所有导入外源KDM6A的尝试都使用了DNA转染方法。非病毒载体脂质体试剂和病毒载体是目前最常用的DNA转染工具。由于膀胱的独特结构，全身给药很难分布到膀胱部位(即被物理屏障阻挡)。相反，膀胱内治疗(即通过导管向膀胱内注入药物)是临床上治疗BCA的常见给药途径。通过膀胱内给药的局部mRNA递送策略可以避免体内不需要的蛋白质和通过全身递送而产生的潜在毒性问题。KDM6A在治疗Kdm6a缺失的BCA转移中具有潜在的治疗潜力。榄香烯联合应用也能提高治疗效果，这可能会扩大这一mRNA策略在癌症治疗与其他治疗药物联合治疗中的应用。

基于mRNA NPs的通用策略在Kdm6a缺失的BCA细胞中按需导入外源和功能蛋白。到目前为止还没有将mRNA应用于BCA细胞，不同的细胞株可能具有不同的转染效率。通过优化的纳米沉淀法设计，带负电荷的mRNA首先通过静电吸附被阳离子脂类G0-C14吸附，然后将络合物有效地包载到可临床使用的PLGA聚合物NP中。从透射电子显微镜(TEM)图像可以观察到，所获得的mRNA NPs结构呈球形，且相对均一(图1a)。纳米颗粒的平均直径为∼130 nm，可以在37℃的磷酸盐缓冲盐水(含10%血清)中保持72小时(图1B)。我们的NPs有效地将mRNA递送到KU19-19细胞，而裸露的mRNA几乎不能进入细胞(图1C)。随着孵育时间的延长，NPs携带的mRNA有效地逃离内体进入细胞质。

KDM6A通过mRNA NPs导入Kdm6a缺失的BCA细胞可抑制BCA细胞的体外侵袭和迁移。

图1. 按需导入外源和功能蛋白至Kdm6a缺失的BCA细胞

我们进一步研究了在Kdm6a缺失的KU19-19细胞中引入KDM6A是否能够抑制细胞的增殖、侵袭和迁移。集落形成实验和细胞增殖实验均表明，KDM6A经mRNA纳米粒导入至Kdm6a缺失的KU19-19细胞中，具有抗增殖作用，这种抑制作用可随KDM6A-mRNA纳米粒浓度的增加而增强。体外Transwell实验模拟Kdm6a缺失的BCA细胞经或不经mRNA NPs处理后的侵袭和迁移。结果表明，KDM6A-mRNA NPs的处理有效地减少了Kdm6a缺失的KU19-19细胞的侵袭和迁移，并呈剂量依赖关系(图2A和B)。体外创伤愈合试验进一步证实，mRNA NP介导的KDM6A导入显著抑制了KU19-19细胞的迁移(图2C和D)。因此，KDM6A的缺失可能促进了BCA细胞的体外侵袭和迁移，研究结果表明，在KDM6A缺失的BCA细胞中重新导入功能性KDM6A蛋白可以有效地缓解这些BCA细胞的侵袭和迁移倾向。KDM6A-mRNANP可上调KU19-19细胞E-钙粘附素水平，上皮间充质转化(EMT)过程中的转移相关途径可能受到抑制，这可能进一步阻止其在体外的侵袭和迁移。

在这部分研究中，为了研究KDM6A对BCA转移的影响，我们在转录水平上分析了这些基因的表达。对Kdm6a缺失的KU19-19细胞和Kdm6a野生型RT-4细胞之间的基因表达差异进行的分析表明，Kdm6a缺失加强了焦点黏附和细胞黏附分子(CAMS)途径。由于这两条途径都与肿瘤转移密切相关，这些结果表明Kdm6a缺失在BCA的转移中具有潜在的促进作用。同时与黏附途径相关的基因在Kdm6a缺失的KU19-19细胞中表达最显著。此外，经基因集浓缩分析证实的结果还表明，与Kdm6a野生型RT-4细胞相比，Kdm6a缺失的KU19-19细胞的焦点黏附信号通路(*P<0.001)和CAMS信号通路(*P<0.05)均显著上调。

图2.   mRNA NPs在Kdm6a缺失的BCA细胞中恢复KDM6A表达，抑制与转移相关的途径，并在体外阻止BCA细胞的侵袭和迁移。

为了进一步研究KDM6A在BCA转移中的作用，我们还对KDM6A缺失的KU19-19细胞(对照组)和KDM6A-mRNANP处理的Kdm6a缺失的KU19-19细胞(KDM6A-mRNANPs组)进行了转录分析。在Kdm6a缺失的KU19-19细胞中，通过mRNA NPs修复KDM6A后，1,608个基因显著下调，3,534个基因显著上调(与对照组相比)(图3A)。其中，转移相关基因，如ITGB5、MMP9、CDH11、MMP10等显著下调。与对照组和空白NPs组相比，KDM6A-mRNA NPs处理后Kdm6a缺失的KU19-19细胞中表达显著下调(图3B)。与先前的结果一致，KEGG通路分析表明，与焦点黏附和细胞迁移途径相关的基因在Kdm6a缺失的KU19-19细胞中表达最显著，而Kdm6a缺失的KU19-19细胞在KDM6AmRNA NPs处理后表达最显著(图3C)。总之，这些转录水平的发现支持Kdm6a的缺失可能促进BCA的转移，而通过mRNA NPs恢复KDM6A可能抑制BCA的侵袭趋势。

图3. Kdm6a缺失的KU19-19细胞(对照组)和KDM6A-mRNA NP处理的Kdm6a缺失的KU19-19细胞 (KDM6AmRNA NPs组)之间的转录分析。

为了延长mRNA在膀胱中的滞留时间，提高其摄取和渗透能力，将其表面功能化，使其具有粘附性，使其能够附着在膀胱上，从而持续有效地在膀胱中递送mRNA。为了更好地模拟临床膀胱治疗中的活动，在相同的治疗过程中使用不同的NPs，我们分别将膀胱与尿液在37°C下孵育3小时，然后进行简单的PBS清洗(图4B)。几乎所有膀胱壁上的信号都消失了。然而，所有三种粘附性mRNA NPs都在膀胱壁上产生了可检测到的信号。此外，研究结果还表明，在三种粘附性mRNA中，mRNA具有最高的黏附能力和摄取能力。通过体内膀胱组织黏附试验，从小鼠膀胱组织切片中进一步证实了不同的Cy5mRNA NPs(图4C)膀胱内注射后的结果。这些结果可以用以下事实来解释：硫代化的NPs能够与粘液糖蛋白的富含半胱氨酸的结构域形成-S-S-键，并且这种共价键的相互作用比非共价相互作用强得多。由于mRNA-SH对有效的膀胱内递送mRNA表现出最好的粘附性。

图4. 设计表面粘附性mRNA纳米粒以有效地在膀胱内递送mRNA。

粘附性mRNA纳米粒可恢复Kdm6a缺失BCA原位移植瘤小鼠的KDM6A，并抑制肿瘤向邻近组织和淋巴系统的转移。为了验证KDM6A通过粘附性mRNA NPs修复BCA的功能结果，我们建立了Kdm6a缺失的KU19-19裸鼠原位膀胱癌模型。KDM6A-mRNANPs-SH治疗组与PBS组或空NPs-SH组相比，能有效地抑制原发膀胱肿瘤的生长。免疫组织化学(IHC)染色显示，KDM6A-mRNA NPs-SH处理后，KDM6A蛋白在KU19-19-19原位肿瘤切片中广泛表达，而PBS或空NPs-SH处理的动物肿瘤切片中未见KDM6A蛋白的表达。此外，通过粘附性纳米粒膀胱内注射KDM6A mRNA也显著减少了发生肿瘤转移的小鼠数量和转移淋巴结数目，表明粘液粘附性mRNA纳米粒引入的KDM6A在体内抑制BCA转移的治疗潜力。与KDM6A-mRNANPs-SH组相比，PBS组和空NPs-SH组的BCA原位肿瘤扩张的膀胱较大，膀胱的正常结构受到原位BCA肿瘤的严重破坏(图5A和B)。苏木精-伊红(H&E)染色显示，KDM6A-mRNA NPs-SH膀胱灌注治疗能有效抑制原发BCA肿瘤的生长，阻止原发BCA细胞向粘膜层和肌层的侵袭(图3)，避免BCA转移，保护膀胱结构。KDM6A-mRNANPs-SH处理组能有效抑制血管(BV)和淋巴管(L-V)的侵袭。此外，KDM6A通过KDM6A-mRNANPs-SH的体内表达也能显著抑制BCA的淋巴结转移(图5 D-F)，表明KDM6A对BCA的转移具有治疗潜力。KDM6A通过粘附性mRNA纳米粒导入到原位移植瘤小鼠体内，可以抑制肿瘤的邻近组织转移和淋巴转移，进一步表明KDM6A在BCA转移中起着关键的治疗作用。

图5. 通过粘附性mRNA将KDM6A导入BCA原位肿瘤的小鼠体内可以抑制BCA的转移潜能。

为阐明KDM6A在体内抑制BCA转移的可能机制，收集了不同治疗方法的小鼠原位BCA肿瘤(图6A)，并对这些肿瘤进行了进一步的染色分析。与先前的体外数据(图2E)一致，观察到KDM6A由KDM6A-mRNA NPS-SH引入肿瘤切片后有效地上调了E-钙粘附素的表达(图6B-D)。为了进一步证实KDM6A在抑制BCA转移中的作用，我们还进行了Western印迹(WB)分析，检测了几种典型的转移表型标记物在不同治疗后的BCA原位肿瘤中的表达。随着KDM6A缺失的原位BCA肿瘤中KDM6A的重新表达，通过KDM6A-mRNANPs-SH，WB分析也证实了E-钙粘附素的表达增加，提示KDM6A介导的E-钙粘附素上调可能抑制BCA的转移潜能。此外，KDM6A体内修复可不同程度地抑制间充质标志物Vimentin、N-Cadherin、 SNAIL和SLUG 的表达。由于N-Cadherin通常通过EMT在促进肿瘤迁移中发挥积极作用，通过KDM6A-mRNANPs-SH导入KDM6A也可能通过下调N-粘附素的表达而成功地阻止肿瘤的迁移过程。综上所述，这些数据表明，通过粘附性mRNA NP膀胱内递送KDM6A修复KDM6A可能通过EMT中的信号通路抑制BCA转移。

图6. 通过粘附性mRNA介导的策略在Kdm6a缺失的BCA肿瘤中局部修复KDM6A，以从机制上了解KDM6A在体内抑制BCA转移中的作用。

从癌症基因组图谱数据库中可以总结出，在不同的癌症类型中，Kdm6a的BCA突变率最高(29.37%)。表明其在BCA中可能起关键作用。KDM6A低表达的BCA患者的BV侵袭性和LV侵袭性的数目(N)和百分比(%)均显著高于KDM6A高表达的BCA患者，进一步提示KDM6A在BCA侵袭转移中的临床意义。进一步分析BCA患者的临床病理特征与KDM6A表达的相关性。这些结果清楚地表明，侵袭性和转移性BCA中KDM6A的表达明显降低。粘附性mRNA NP策略修复KDM6A可能对治疗BCA患者和防止侵袭和转移具有重要的临床意义。

最近，新兴的mRNA技术在不同领域引起了相当大的关注，包括针对新冠肺炎等传染病的疫苗，糖尿病患者再生血管生成的药物，癌症治疗的肿瘤抑制因子修复，遗传性代谢性肝病的靶向治疗和精氨酸酶缺乏等。mRNA本质上是一种单链核酸分子。与DNA转染不同的是，mRNA的保留时间是暂时的，一旦实现了特定的功能，它就会被降解。由于mRNA不需要入核即可完成其转染活性，因此不具有整合到宿主基因组和潜在的有害遗传毒性。原则上，一种mRNA药物可以表达多种蛋白质，这为多阶段疫苗或多蛋白质联合治疗提供了便利。然而，一种有效的向原位膀胱肿瘤运送mRNA以表达靶蛋白的方法仍然是一个主要的挑战。

新兴的纳米技术为改善不同的RNA治疗药物进入癌细胞提供了机会，一些NPs已被用于系统的mRNA递送。为了在局部有效地引入蛋白质，NPs需要克服与膀胱内mRNA递送相关的不同障碍，例如核酸酶降解、通过尿液快速清除、缺乏持续递送的停留时间以及不充分的mRNA从内体逃逸到细胞质。我们设计了一种脂质-聚合物杂化NP平台，其中：1.用带正电荷的G0-C14吸收mRNA并促进内体逃逸；2.用FDA批准的PLGA聚合物负载mRNA/C0-C14复合体，避免血清核酸酶对mRNA的降解。用DSPE-PEG-SH、DSPE-PEG-NH2或它们的杂交物构建黏附性mRNA纳米粒，使其在膀胱内停留时间延长，并改善对BCA组织的摄取，以便将mRNA送入膀胱内。结果表明，KDM6A-mRNA可以被有效地负载到粘附性NPs中，该粘附性NPs可以粘附性地将mRNA递送到Kdm6a缺失的原位膀胱肿瘤中，并表达KDM6A。然而，由于目前的设计仅限于用于增强粘附性的mRNA纳米粒的表面工程，因此需要使用额外的靶向配体进行表面修饰，以实现靶向或更特异的mRNA递送到肿瘤细胞，以进一步推进该mRNA递送平台在治疗BCA中的临床应用。