脂质纳米颗粒（LNPs）已成为mRNA治疗药物的主要递送系统，这得益于它们能够保护mRNA免受降解并促进细胞摄取。LNPs的疗效显著受其结构特性的影响，而这些特性与可电离脂质的pH依赖性电离密切相关。尽管已有大量研究，但对LNPs在生理和内体pH条件下的结构变化的详细理解仍然有限。最近，德国Peter Langguth 团队在Journal of Controlled Release 上发表题为“Direct structural investigation of pH responsiveness in mRNA lipid nanoparticles: Refining paradigms”的研究。本研究旨在通过直接使用SAXS技术调查LNP结构的pH响应性，填补这一空白。

01
实验结果

通过SAXS技术，我们系统地研究了四种不同可电离脂质（DODAP、DODMA、DLin-MC3-DMA（MC3）和ALC-0315）组成的LNPs在pH变化下的结构响应。结果显示，这些LNPs在pH值从4.5到8.0的范围内，其散射曲线呈现出相似的整体特征，但也存在显著差异（图1）。具体而言，所有LNPs的SAXS曲线均包含一个明显的布拉格峰，该峰源于mRNA与脂质重复堆叠产生的有序结构。随着pH值的增加，布拉格峰的位置向低q值移动（即d间距增加），峰宽增加且峰面积减小，表明结构有序性降低。

Fig. 1. SAXS measurements for mRNA-LNPs with different ionizable lipids (from left to right: DODAP, DODMA, DLin-MC3-DMA, ALC-0315)

d间距：对于所有测试的脂质，d间距均随pH值的增加而增加，但变化范围因脂质类型而异。MC3和ALC-0315 LNPs的d间距在pH变化下表现出较小的变化范围，而DODAP和DODMA LNPs的d间距变化更为显著（图2A）。

峰宽与峰面积：峰宽的增加和峰面积的减小表明，随着pH值的增加，LNP内部的有序结构逐渐失去相关性。活性较高的脂质（MC3和ALC-0315）在较高pH下仍能保持较高的结构有序性，而活性较低的脂质（DODAP和DODMA）则表现出更明显的结构失序。

表面分形维数：通过分析低q区域的强度衰减，我们计算了LNPs的表面分形维数。结果表明，活性较高的脂质（MC3和ALC-0315）在低pH值下具有较高的表面分形维数，表明其表面粗糙度增加（图2C）。这一发现与LNPs的生物活性相关，因为表面粗糙度的增加可能促进内体逃逸。

Fig. 2. Analysis of SAXS derived parameters as a function of pH.

为了探索脂质与mRNA比例（N/P比）对LNP结构的影响，我们对DODMA和MC3 LNPs在不同N/P比（0.2至5）下进行了SAXS测量。结果显示，N/P比显著影响了LNPs的结构特性（图3-4）。随着N/P比的增加，LNPs的整体d间距减小，表明mRNA/脂质堆叠的垂直堆积密度增加。

d间距：在低N/P比下制备的LNPs具有较大的d间距，表明其内部结构较为松散。随着N/P比的增加，d间距逐渐减小，表明mRNA与脂质之间的相互作用增强，形成了更紧密的结构。

峰宽与峰面积：峰宽的变化趋势与d间距相似，随着N/P比的增加而减小。峰面积的变化则更为复杂，反映了LNP内部结构复杂性的增加。

表面分形维数：低N/P比下制备的LNPs具有较高的表面分形维数，表明其表面粗糙度较大。随着N/P比的增加，表面分形维数逐渐降低，但在低pH值下仍能保持较高的值。

结构pKa的变化： 我们观察到结构pKa值随N/P比的增加而降低。这一发现表明，通过调整N/P比可以微调LNP的pH响应性。对于DODMA LNPs，当N/P比从0.2增加到5时，结构pKa值从8.6降低到7.0；对于MC3 LNPs，结构pKa值从8.6降低到6.5（图5）。这种依赖性为LNP的优化提供了额外的自由度，使得可以根据特定治疗目标调整LNP的pH响应性。

Fig. 3. Results of SAXS measurements of LNPs with N/P ratio variations.

Fig. 4. Results of peak analysis for DODMA (left) and MC3 (right) LNPs of varying N/P ratio (black: N/P 0.2, red: N/P 0.65, green: N/P 2, dark blue: N/P 4, light blue: N/P 5).

Fig. 5. Apparent pKa (black, as determined with TNS-assay) and structural pKa (red, as determined by SAXS analysis) as a function of N/P ratio of the LNP formulations.

02
讨论

本研究通过SAXS技术直接调查了mRNA LNPs的pH响应性结构变化，提供了比传统荧光测定法更准确的实际pH依赖性行为信息。我们发现，具有较高生物活性的可电离脂质具有更高的mRNA/脂质堆叠垂直堆积密度和随pH降低而增加的表面粗糙度。此外，N/P比对LNP的结构pKa有显著影响，为LNP的优化提供了额外的自由度。这些发现为理性设计具有特定治疗目标的mRNA LNPs提供了有价值的结构信息。