随着SARS-CoV-2和流感病毒等新兴呼吸道病原体的广泛爆发，黏膜疫苗作为预防和控制这些疾病的有效手段，受到了广泛关注。与传统肌肉注射疫苗相比，黏膜免疫特别是肺内给药途径，能够刺激呼吸道局部免疫防御。脂质纳米颗粒（LNP）作为非病毒RNA递送系统的前沿技术，已成为所有已批准RNA疗法的递送载体。壳聚糖作为一种广泛应用于黏膜药物递送的聚合物，带有强正电荷，能够通过静电相互作用或氢键与黏蛋白的寡糖链结合，从而增强黏膜黏附性和紧密连接的开度，克服黏膜屏障。甘露糖受体在免疫细胞膜上高度表达，能够介导免疫细胞内吞作用，并通过Toll样受体（TLR）信号通路激活树突状细胞（DCs），促进抗原向CD4+和CD8+T细胞的递呈，从而触发强烈的免疫应答。尽管CS和Man分别作为黏膜递送增强剂或免疫靶向配体已被单独研究，但尚未有报道将两者功能合理整合用于肺内递送，特别是在mRNA-LNP领域。最近，军事医学研究院毒物药物研究所郑爱萍团队在Journal of Controlled Release 发表题为“Chitosan and mannose-modified dual-functional mRNA-LNP vaccines for robust systemic and mucosal immune responses"的研究。本研究旨在开发一种基于CS和Man修饰的双功能mRNA-LNP疫苗，通过肺内给药途径高效克服呼吸道黏膜屏障，靶向肺部免疫细胞，诱导强效的全身和黏膜免疫应答。

示意图

01
实验结果

研究通过调整DMG-PEG2000-CS和DMG-PEG2000-Man的摩尔比例，确定了1.2 mol% DMG-PEG2000-CS和0.3 mol% DMG-PEG2000-Man的组合为最优配方（LNP-1.2CS+0.3Man）。

Fig. 1. Preparation and characterization of LNP-1.2CS+0.3Man.

研究显示LNP-1.2CS+0.3Man在DC2.4、RAW264.7、HEK293T和Calu-3细胞中均表现出最高的转染效率和平均荧光强度（MFI），显著优于未修饰的LNP和其他单一修饰的LNP组。这可能是甘露糖受体介导了其高效的细胞摄取。LNP-1.2CS+0.3Man显著促进了小鼠骨髓细胞向树突状细胞（BMDCs）的分化、成熟和激活，表现为CD40、CD80和CD86等共刺激分子的表达上调。并分泌了更高水平的IL-6和TNF-α等细胞因子，进一步证实了其免疫增强作用。

Fig. 2. In vitro cellular evaluation of LNP-1.2CS+0.3Man.

研究发现LNP-1.2CS+0.3Man在肺内广泛分布于气管、支气管和肺实质，且在内皮细胞、上皮细胞和白细胞中均有高效表达。显著优于未修饰的LNP和其他单一修饰的LNP组。并发现LNP-1.2CS+0.3Man显著提高了肺内CD11c+抗原递呈细胞（APCs）的mRNA转染效率，表明其能够高效靶向肺部免疫细胞。

Fig. 3. Distribution and expression of LNP-1.2CS+0.3Man in mouse lungs.

两次免疫后，LNP-1.2CS+0.3Man气管内给药组显著诱导了血清中RBD特异性IgG和IgG2a抗体的产生，且IgG2a/IgG1比值大于1，表明其诱导了Th1偏向的免疫应答。在支气管肺泡灌洗液（BALF）中，LNP-1.2CS+0.3Man组同样显著诱导了RBD特异性IgG和分泌型IgA（SIgA）抗体的产生，表明其能够有效诱导肺黏膜免疫应答。LNP-1.2CS+0.3Man组显著增加了肺内生发中心B细胞（GC B细胞）的数量，表明其促进了B细胞的活化和抗体产生；并显著增加了肺内CD44+和TRM细胞的数量，表明其能够建立有效的免疫记忆。

Fig. 4. LNP-1.2CS+0.3Man elicits robust systemic and mucosal immune response.

LNP-1.2CS+0.3Man免疫小鼠在SARS-CoV-2 D614G假病毒挑战后，肺内感染水平显著低于未免疫组和其他LNP组，表明其提供了优秀的保护效果。血清中和实验显示，LNP-1.2CS+0.3Man组诱导了高水平的中和抗体，其滴度与肌肉注射的mRNA-1273 LNP制剂相当，但肺黏膜免疫应答显著更强。

Fig. 5. LNP-1.2CS+0.3Man effectively neutralizes SARS-CoV-2 D614G pseudovirus.

02
结论

本文开发了一种基于壳聚糖（Chitosan, CS）和甘露糖（Mannose, Man）修饰的双功能脂质纳米颗粒（LNP）疫苗（mRNA-LNP-CS+Man），旨在通过肺内给药途径克服呼吸道黏膜屏障，实现高效的抗原递送和免疫细胞靶向。研究结果显示，mRNA-LNP-CS+Man在肺内表现出长达72小时的持久滞留，广泛分布于整个肺部，并在免疫细胞中实现高效mRNA转染。两次免疫后，该疫苗相比未修饰的LNP，显著诱导了全身和黏膜免疫应答，包括血清中高效产生的IgG和IgG2a抗体、支气管肺泡灌洗液中的IgG和分泌型IgA（SIgA）抗体，以及Th1型细胞因子的产生。此外，疫苗还显著激活了肺生发中心B细胞和组织驻留记忆T细胞（TRM细胞），并建立了有效的免疫记忆。在SARS-CoV-2 D614G假病毒挑战实验中，该疫苗在肺内表现出强大的保护效果，为mRNA黏膜疫苗的开发提供了新策略。