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本研究开发了一种新型基因递送系统LNP-ssDNA-T7RNAP，通过脂质纳米颗粒共递送单链DNA模板与T7RNA聚合酶，在哺乳动物细胞质中实现不依赖核进入的持续基因表达。该系统利用T7RNAP在细胞质中转录ssDNA模板产生mRNA，再通过IRES介导的非帽依赖性翻译机制合成目标蛋白；通过系统优化引物长度、引物与模板比例、T7RNAP递送方式及5′端硫代磷酸修饰，显著提升了转录效率与表达持久性。以此构建的猴痘双抗原（L1R和A33R）疫苗在小鼠中单剂接种即可诱导强烈的抗原特异性体液免疫应答，且未检测到组织毒性，证明该平台兼具高效递送、持续表达与良好安全性，为疫苗及基因治疗提供了新策略。

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实验结果

Experimental

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T7RNAP在哺乳动物细胞中的细胞质定位及其驱动的DNA转录

研究者构建了mCherry-T7RNAP融合蛋白，荧光成像证实其严格定位于细胞质（图1B）；将含T7启动子、IRES、EGFP编码序列及poly(A)尾的双链DNA模板与T7RNAP质粒共转染HEK293T细胞后，观察到明亮EGFP荧光（图1C），证明T7RNAP能在细胞质中有效转录外源DNA模板，并通过IRES实现功能性蛋白表达，为不依赖细胞核的转录翻译奠定了基础。

图1. T7RNAP驱动DNA模板在哺乳动物细胞中的胞质表达。

T7RNAP介导的ssDNA模板在哺乳动物细胞中的转录

通过λ外切核酸酶法制备了含T7启动子、IRES、EGFP及poly(A)的2039 nt ssDNA模板（图2A），并在体外与44 nt互补引物退火形成T7启动子区局部双链结构；将该ssDNA模板与T7RNAP质粒共转染HEK293T细胞后，成功检测到EGFP表达（图2C），流式细胞术显示其表达效率与dsDNA模板相当，证明ssDNA可作为功能性转录模板，且其分子柔性与mRNA相似，更适于LNP包封递送。

图2. T7RNAP在哺乳动物细胞中介导的单链DNA转录。

T7RNAP驱动ssDNA模板转录的系统性优化

以萤火虫荧光素酶（Fluc）为报告基因，将T7RNAP的递送方式改为mRNA后，共转染仍产生120倍升高的荧光素酶活性（图3B）；优化互补引物长度发现74 nt引物表达最高（图3C），因该长度既能稳定覆盖T7启动子及附近茎环结构，又不形成抑制退火的分子内二级结构；ssDNA与引物的摩尔比以1:10最优（图3D），mRNA-T7RNAP与ssDNA的质量比以2:1即可达到近饱和表达（图3E），这些参数协同实现了细胞质内高效的持续转录。

图3. 在不同条件下优化T7RNAP驱动的单链DNA模板转录。

5′端硫代磷酸修饰增强LNP-ssDNA-T7RNAP系统的表达持久性

未修饰ssDNA模板的荧光素酶活性在48 h后下降约40%（图4A）；通过在ssDNA 5′端引入硫代磷酸修饰以抵抗胞外切酶降解（图4B），修饰后模板在24 h产生的mRNA水平较未修饰组提高67.7%，且蛋白输出在48 h和72 h分别提升约60%（图4C），显著延长了基因表达时间，证明化学修饰可有效增强ssDNA模板在细胞质中的稳定性与表达持久性。

图4. 单链DNA模板的5'-硫代磷酸化修饰随时间推移增强基因表达。

LNP-ssDNA-T7RNAP猴痘疫苗的小鼠体内评价

将编码L1R和A33R两种猴痘表面抗原的ssDNA与mRNA-T7RNAP共同包封于LNP中（图5A），所得纳米颗粒粒径约117 nm且分布均匀（图5B）；BALB/c小鼠单剂肌肉免疫后，血清ELISA显示抗原特异性IgG抗体在第7天即可检出，并持续升高至第28天（图5D），且与LNP-mRNA疫苗相比具有更持久的抗体上升趋势；第28天对心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行H&E染色，未见炎症、坏死或组织损伤（图5E），血液生化指标亦显示无明显毒性，证明该疫苗平台在体内安全且能有效诱导强烈体液免疫应答。

图5. LNP-ssDNA-T7RNAP系统作为Mpox疫苗候选物的评估。

小结

Result

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本研究建立的LNP-ssDNA-T7RNAP基因递送系统，利用LNP高效共递送ssDNA模板T7RNAP，在哺乳动物细胞质中实现了不依赖细胞核的持续、稳健基因表达。系统优化后，5′端硫代磷酸修饰的ssDNA模板可维持长达72小时以上的高效蛋白输出。基于该平台构建的猴痘双抗原疫苗在小鼠中单剂接种即可诱导快速、强烈且持久的抗原特异性抗体反应，且无显著组织毒性。该策略融合了RNA递送的高效性与DNA表达的稳定性，为新一代非病毒基因治疗与疫苗开发提供了安全、模块化的新平台。

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参考文献：Zhang K, Liu C, Ge R, Zhang Z, Liu Q, Mo O, Li X, Liu X, Li H, Hao P. Lipid nanoparticle (LNP)-mediated cytoplasmic expression of single-stranded DNA and its application in Mpox vaccine. J Control Release. 2026 Apr 10;392:114740. doi: 10.1016/j.jconrel.2026.114740. Epub 2026 Feb 18. PMID: 41720270.