为探究降低可电离脂质含量后转染效率提高的机制基础，研究评估了30%与50%组（Moderna）以及30%与46.3%组（Pfizer/BioNTech）的细胞摄取和内体逃逸情况。20%组因转染效率显著降低被排除在机制研究之外，推测其效率降低可能归因于mRNA-LNP相互作用过弱，导致mRNA在胞外或胞内环境中被核酸酶降解或与阴离子生物分子交换。通过用NBD-胆固醇标记mRNA-LNP，流式细胞术（图3a）和荧光显微镜（图3b）分析显示各组间细胞摄取水平相当，提示差异内化并非30%组增强转染的原因。随后评估内体逃逸——mRNA细胞质递送的关键步骤。共聚焦显微镜显示，两组间NBD-胆固醇标记的mRNA-LNP（绿色）与LysoTracker标记的内体/溶酶体（红色）共定位模式相似（图4a）。Pearson相关系数定量分析表明30%与50%组间内体逃逸效率无统计学差异（图4b）。钙黄绿素释放实验进一步证实两配方间内体破坏水平相当。值得注意的是，尽管可电离脂质含量降低，内体逃逸效率仍得以维持，表明大量可电离脂质对有效内体破坏并非必需。这些结果共同提示，细胞摄取和内体逃逸均不能解释30%组的优越转染效率，指向内体后过程作为关键差异因素。

鉴于30%与50%组表现出相似的内体逃逸效率，研究假设30%组观察到的改善转染可能源于细胞内mRNA从LNP复合物中增强的解离。推测30%组降低的静电相互作用促进细胞内更大的mRNA释放，从而提高翻译机器的可及性。为评估细胞内mRNA-LNP解离，研究采用双标记策略：以NBD-胆固醇或NBD-SM102（绿色）标记LNP，Cy5（红色）标记mRNA。HEK-293细胞与标记mRNA-LNP孵育6小时后进行共聚焦显微镜分析。在30%组中观察到Cy5与NBD信号的空间分离，表明mRNA从LNP中解离（图5a）；相反，50%组显示Cy5与NBD信号强烈共定位，提示mRNA仍紧密结合于LNP载体。定量共定位分析证实30%组的mRNA-LNP关联程度显著低于50%组（图5b），支持细胞内mRNA释放增加的观点。Pfizer/BioNTech版本mRNA-LNP中也观察到相同趋势。由于游离mRNA必须在细胞质中才能与核糖体结合并翻译，这种增强的解离可能解释30%组更高的蛋白表达。相反，50%组中强烈的mRNA-LNP复合作用可能限制翻译可及性，从而降低转染效率。这些发现突出细胞内mRNA释放作为有效mRNA递送的关键步骤，与内体逃逸不同，并强调调控mRNA-脂质相互作用以优化翻译效率的重要性。

基于体外转染效率的增强，研究进一步评估了mRNA-LNP配方的体内性能。小鼠肌肉注射后，生物发光成像显示30%组产生显著高于50%组的荧光素酶表达（图6a-b），与体外发现一致。为评估全身递送，研究进行了静脉注射（图6c-d）。与肌肉注射结果一致，30%组在肝脏（静脉注射后mRNA-LNP主要蓄积部位）表现出显著升高的荧光素酶表达。这些发现证明调节可电离脂质含量以实现最佳mRNA-脂质结合可增强体外和体内mRNA表达。