脂质纳米颗粒（LNP）是目前临床上最先进的 mRNA 非病毒递送平台，已广泛应用于mRNA疫苗、肿瘤治疗和蛋白替代疗法。mRNA/LNP 的疗效不仅取决于脂质组成，也受制备工艺调控，后者决定了mRNA/LNP的粒径、包封率和颗粒结构等关键质量属性（CQA），进而影响其体内外行为。现有研究主要通过调控微流控混合工艺优化mRNA/LNP，如流速（FR）和流速比（FRR）等参数。然而，越来越多的证据表明，mRNA/LNP的形成并非在微流控混合瞬间完成：在混合后的下游稀释、溶剂交换和纯化阶段，LNP 仍持续发生脂质重排、膜结构重组和颗粒重构。

其中，稀释方法对mRNA/LNP的影响仍缺少系统研究。目前生产放大中主要存在两种稀释策略：离线稀释（OD）先将新鲜制备的LNP收集后静置，再进行稀释；在线稀释（ID）则在混合之后立即引入稀释缓冲液，快速降低乙醇浓度。最近，上海交通大学附属仁济医院杨太华团队和迈安纳黄雷团队在药剂学顶级期刊 Journal of Controlled Release 发表名为“Dilution mode acts as a critical process parameter that reprograms lipid nanoparticle assembly and in vivo mRNA delivery”的最新研究。本研究采用DOE策略，系统比较了两种代表性的稀释方法，在不同流速（FR）、流速比（FRR）和稀释比（DR）条件下的区别，旨在明确稀释方式能否作为 LNP 结构-功能关系的独立影响因素，并重新定义其在LNP生产放大中的角色。

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研究按照 L9（3⁴）DOE 表，在 9 种不同微流控混合工艺条件下（P1–P9）系统比较不同稀释工艺对 SM-102 mRNA/LNP 理化性质的影响。结果显示，即使在微流控混合条件完全相同的情况下，两种稀释方式仍产生了显著不同的理化特征：ID 在九个条件中的七个条件下产生更小的颗粒，剔除呈相反趋势的 P7 后，ID 粒径较 OD 显著降低 19.8%（91.1 vs. 115.7 nm，p < 0.001，Fig. S2A）；PDI 总体相近。多数条件下 ID 的包封率（EE）更低，剔除 P1 后 OD 的 EE 显著高于 ID（83.3% vs. 63.3%，p < 0.05，Fig. S2C）；Zeta 电位随 EE 呈相似趋势。除 SM-102 脂质之外，本研究还考察了不同稀释工艺对 ALC-0315 和 Lipid-5 两种可离子化脂质的影响（Fig. S3），结果显示稀释工艺由 OD 切换为 ID 同样引起 ALC-0315 和 Lipid-5 LNP 粒径与 EE 的降低，表明粒径和 EE 下降是 ID 过程的普遍性结果，而非 SM-102 依赖的现象。

Table 1. Mixing and dilution methods of mRNA/LNP

Fig. 1. Influence of dilution methods on the physicochemical properties of mRNA/LNP. (A) Schematic of the LNP preparation method with different dilution methods. Comparison of mRNA/LNP prepared by OD and ID regarding (B) size, (C) PDI, (D) EE, (E) Zeta potential. 

研究在小鼠肝细胞系AML12、成肌细胞系C2C12和树突状细胞系DC2.4中评估了稀释方法是否对mRNA/LNP的体内外性能产生影响。结果显示细胞对稀释方式的变化具有细胞依赖性：其中，DC2.4细胞中77.8% ID制备的LNP在DC2.4细胞种的mRNA蛋白表达出现下降（P7、P8除外）；而ID在C2C12和AML12中均显著提高mRNA的转染效率，分别较OD增强3.0倍和1.9倍（p < 0.05, Fig. S13）。体内结果则显示，小鼠肌肉注射后，OD与ID工艺在肌肉注射部位产生相当的mRNA表达，但ID制备的LNP在小鼠上腹部（肝脏部位）的表达更高，显著升高118.1%（p < 0.05, Fig. S14H），这使得ID的肝脏/肌肉表达比值相比OD提高了87.7%（p < 0.05, Fig. S14I）。

Fig. 2. Influence of dilution methods on the in vitro/in vivo performance of mRNA/LNP. Comparison of mRNA/LNP prepared by OD and ID regarding (A) DC2.4 expression, (B) C2C12 expression, (C) AML12 expression. In vivo expression of mRNA/LNPs prepared by OD (D) and ID (E) after i.m. injection. Comparison of mRNA/LNP prepared by OD and ID regarding (F) muscle expression, (G) liver expression, and (H) the liver-to-muscle ratio.

本研究通过DOE分析了两种稀释模式下截然不同的关键工艺参数特征。在OD条件下，FR在20–40 mL/min范围内对理化性质影响甚微，但30 mL/min在所有细胞类型中均具有最好的表达效率（Fig. S15A）；此外，FRR在OD条件下起主要调控作用，FRR升高可产生更小粒径、更高EE和更高的表面电荷。在功能上，高FRR显著降低DC2.4转染（R² = 0.80，p = 0.001），而FRR = 3则有利于肌肉和肝脏表达并改变肝脏/肌肉分布比例（Fig. S15B）；DR在OD下对理化性质和表达影响较小。

在ID条件下，FR（尤其30 mL/min，Fig. S15C）可显著影响mRNA/LNP的体内外表达，能够提高细胞表达、肝脏表达及肝/肌比；FRR的影响较OD减弱，而DR成为调控理化性质的主导因素，DR提高可导致粒径增大、PDI升高、EE降低和表面电荷更负，但对转染效率影响有限。

Fig. S15 & S16. The effect of preparation parameters on mRNA/LNP prepared by the OD and ID method.

本研究优选P1、P4、P6、P8、P9五种工艺（EE > 70%）进行后续测试，并在AML12和DC2.4细胞中评估细胞摄取与溶酶体共定位。在AML12细胞中，稀释与混合方式均显著影响细胞中Cy5信号，总体上ID摄取优于OD（Fig. 3A-3B，P1除外）；在DC2.4细胞中观察到类似规律，ID摄取普遍高于OD（P1除外），EE与DC2.4摄取呈正相关，且OD下DR从1增至3使摄取降低44.5%（p < 0.0001）。

溶酶体共定位分析显示，两种稀释与混合方式均显著影响AML12细胞中mRNA/LNP与溶酶体的共定位。除P6外，OD制备的LNP溶酶体共定位水平均低于ID对应物，提示其具有更优的内体逃逸能力，其可能的原因是OD可使LNP形成更成熟的内部结构，从而促进与溶酶体膜融合及mRNA胞质释放。

Fig. 4. Effects of dilution method on lysosomal co-localization of mRNA/LNP. (A) Images of AML12 cells treated with various mRNA/LNP formulations, scale bar = 10 μm. Quantification of colocalization of Cy5 and FITC, analyzed by (B) dilution methods and (C) mixing methods. (D) Influence of FRR on colocalization in AML12 cells. (E) Influence of FR on colocalization in AML12 cells under ID conditions.

本研究通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）观察两种稀释方式制备的LNP形态，发现两者总体相近，唯一例外出现在工艺P9：OD9相对于ID9具有更多的（bleb）结构，这可能源于两种模式下DR作用的差异，即高DR伴随快速稀释，压缩了结构变化的时间窗口。DR对bleb形成有显著影响，DR增大对应bleb比例降低，凸显了DR在塑造颗粒结构中的关键作用；ID组间bleb异质性更大（ID6最高达13.0%，ID9则近球形几乎无bleb），而OD组形态更为均一。相关性分析显示bleb结构与注射部位荧光素酶表达呈负相关（R² = 0.40，p = 0.048），且bleb比例与溶酶体共定位间未见明确关联，提示肌肉表达与bleb形态的关系可能由内体逃逸以外的机制介导。

Fig. 5. Effects of dilution and mixing method on mRNA/LNP morphology. (A) Morphology characterization of mRNA/LNP, scale bar = 100 nm. (B) Quantification of bleb ratio. (C) Influence of DR on bleb ratio. (D) Correlation between bleb ratio and luciferase expression in muscle after i.m. injection.

本研究以SARS-CoV-2刺突蛋白为模型抗原评估不同工艺条件下mRNA/LNP诱导产生的抗原特异性免疫原性。结果显示，二次免疫后14天，OD9抗体滴度显著高于ID9（151,060 vs. 57,920 ng/mL，p < 0.01，Fig. 6B）。此外，ID条件下，微流控混合条件可显著影响抗体产生，其中ID6抗体浓度最高（221,180 ng/mL），并显著高于ID8和ID9，而OD各条件间无显著差异（Fig. 6C）。细胞免疫方面，OD制备的LNP诱导的IFN-γ应答显著强于ID（2.1倍，p < 0.0001，Fig. 6D）。混合条件同样影响细胞免疫反应：OD和ID条件下P1和P6均表现较好。相关性分析显示粒径与IFN-γ分泌呈正相关（R² = 0.57，p = 0.012），但这种粒径效应在刺突特异性IgG滴度中并未观察到，提示在本研究中粒径可能主要影响细胞免疫而非体液免疫。

Fig. 6. Effects of dilution and mixing method on spike-specific IgG antibody and IFN-γ ELISpot responses elicited by mRNA/LNPs. (A) Schematic outline of the experimental protocol. Spike-specific antibody levels analyzed by the mixing method (B) and dilution method (C). (D) Comparison of ELISpot counts between OD and ID methods. Normalized ex vivo IFN-γ ELISpot counts for the spike antigen in splenocytes analyzed by the mixing method (E) and dilution method (F). (G) Correlation between ELISpot counts and particle size.