CAR-T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤治疗中取得了显著成效，但其复杂的体外制备流程、高昂的治疗成本及需要化疗清淋等限制了其广泛应用。体内CAR-T细胞疗法作为一种新兴的治疗策略，通过直接在患者体内生成CAR-T细胞，有望解决上述问题。2025年6月19日，Capstan Therapeutics公司在Science上发表题为“In vivo CAR T cell generation to treat cancer and autoimmune disease”的研究。本文旨在探讨利用tLNP技术在体内生成CAR-T细胞治疗癌症与自身免疫性疾病的可行性和有效性。

01
材料与方法

tLNP设计与制备：本研究设计了一种新型tLNP，由五种脂质成分组成，包括可电离脂质（L829）、靶向部分（如抗体）和包裹的mRNA负载物。L829脂质被设计用于减少肝脏摄取，提高向免疫细胞的mRNA递送效率。通过将抗CD5或抗CD8抗体偶联到L829-tLNP上，实现了对T细胞的特异性靶向。

mRNA设计与优化：为提高CAR在T细胞中的表达效率和持久性，对mRNA序列进行了多重优化，包括筛选不同的非翻译区（UTR）组合和调整CAR基因的密码子使用频率。优化后的CAR mRNA在体外实验中表现出显著提高的CAR表达水平和更强的肿瘤杀伤能力。

动物实验：在健康供体和自身免疫性疾病患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中验证了tLNP的靶向性和CAR-T细胞生成能力。使用人源化白血病异种移植小鼠模型和食蟹猴模型评估了体内CAR-T细胞疗法的疗效和安全性。

02
实验结果

1.1 靶向脂质纳米颗粒（tLNP）的靶向性和安全性验证：

靶向性验证：本研究设计的tLNP包含五种脂质成分，其中L829作为可电离脂质，通过与抗CD5或抗CD8抗体偶联，实现了对T细胞的特异性靶向。在生物发光成像实验中，与基准LNP相比，L829-tLNP显著减少了在肝脏中的积累，提高了向T细胞的递送效率。具体而言，CD5-L829-tLNP在脾脏中显示出特异性信号，而在肝脏中的表达显著降低，表明其良好的靶向性（图1B）。

安全性验证：在大鼠和食蟹猴中的毒性研究表明，L829-tLNP具有良好的耐受性和安全性。大鼠实验中，与基准tLNP相比，CD5-L829-tLNP处理的大鼠急性期反应蛋白水平显著降低，且在最高剂量5 mg/kg下未观察到不良反应（图1D）。在食蟹猴实验中，CD5-L829-tLNP在高达3 mg/kg的剂量下静脉注射，与基准tLNP相比，肝脏酶水平较低，表明其更高的安全性（图1E）。

Fig. 1. Ionizable lipid L829 reduces off-target delivery of tLNP to liver.

1.2 体内CAR-T细胞的生成与功能验证：

康供体和自身免疫性疾病患者PBMCs中的验证：在健康供体和自身免疫性疾病患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中，L829-tLNP成功诱导了CD8+ T细胞表达CAR。具体而言，使用抗CD8抗体偶联的L829-tLNP（CD8-L829-tLNP）转染的细胞中，CAR在CD8+ T细胞中的表达显著高于CD4+ T细胞，且转染后的CAR-T细胞显示出抗原特异性细胞毒性、增殖和细胞因子产生能力。

mRNA优化对CAR表达和功能的影响：为提高CAR在T细胞中的表达效率和持久性，对mRNA序列进行了多重优化，包括筛选不同的非翻译区（UTR）组合和调整CAR基因的密码子使用频率。优化后的CAR mRNA在体外实验中表现出显著提高的CAR表达水平和更强的肿瘤杀伤能力。在人源化小鼠模型中，优化后的CAR mRNA通过L829-tLNP转染后，CAR-T细胞在血液、脾脏、骨髓和淋巴结中均显示出高水平的CAR表达，且表达持久。

Fig. 2. Enhancements in anti-CD19 CAR mRNA improve expression and function in T cells.

1.3 动物模型中的疗效评估：

人源化白血病异种移植小鼠模型：在人源化白血病异种移植小鼠模型中，使用CD8-L829-tLNP-CD19治疗的小鼠表现出显著的肿瘤控制效果。具体而言，30 μg剂量下，所有小鼠在第二次给药后3天内均达到完全肿瘤清除，而10 μg剂量下也显示出显著的肿瘤控制效果（图3G）。此外，治疗后的B细胞在1小时内开始减少，3小时内接近完全消除，且CAR表达在6小时达到峰值，24小时内仍可检测到（图3D-E）。

Fig. 3. tLNPs encapsulating B cell–targeted CAR induce rapid B cell depletion in autoimmune patient samples and humanized mice.

食蟹猴模型：在食蟹猴模型中，多次注射CD8-L829-tLNP-CD20导致B细胞深度耗竭。具体而言，在0.1至2.0 mg/kg的剂量范围内，三次给药后，B细胞在6小时内显著减少，且在较高剂量下（如1.5 mg/kg和2.0 mg/kg），B细胞几乎完全耗竭（图4B）。更新的B细胞主要为初始表型，表明发生了免疫重置（图5）。此外，在1.5 mg/kg剂量下，一只猴子出现类似免疫效应细胞相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症样综合征的不良反应，但其他猴子未观察到严重不良反应。

Fig. 4. Treatment with tLNPs encapsulating B cell–targeted CAR mRNA induces deep B cell depletion in cynomolgus monkeys.

Fig. 5. Predominance of naïve B cells upon B cell lineage recovery after tLNP treatment–induced global B cell depletion.

03
讨论

本研究表明，利用tLNP技术在体内直接生成CAR-T细胞是一种可行且有效的治疗策略。该技术避免了复杂的体外制备流程，降低了治疗成本，并提高了患者的可及性。此外，体内生成的CAR-T细胞可能具有更好的抗肿瘤活性和更低的副作用风险。然而，该技术仍需进一步的临床验证，以确定其在人类患者中的疗效和安全性。未来的研究将聚焦于优化剂量、评估长期疗效，并探索联合治疗策略，以进一步提高体内CAR-T细胞疗法的治疗效果。

参考文献链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.ads8473