在正常小鼠中静脉注射64Cu标记的mRNA-LNPs后，通过PET成像观察到mRNA-LNPs在肝脏中的两步积累过程（图1A和图2A,B）。初始积累迅速达到约10%ID/g，随后经历一个平台期，紧接着在45分钟内再次积累至约30%ID/g。这种两步积累模式表明存在不同的摄取机制。
Figure 1. PET images of mice postintravenous injection of [64Cu] Cu-mRNA-LNP. Representative maximum intensity projection PET images of normal mice (A), ApoE-deficient mice (B), and macrophage-depleted mice (C) postinjection of [64Cu] Cu-mRNA-LNP.
静脉注射后ApoE缺陷小鼠和巨噬细胞耗竭小鼠的PET药代动力学分析
在ApoE缺陷小鼠中，静脉注射64Cu标记的mRNA-LNPs后，肝脏中的两步积累现象消失，仅观察到缓慢的持续积累（图1B和图2C,D）。这表明ApoE在第二步积累中的关键作用。
相比之下，巨噬细胞耗竭小鼠的肝脏药代动力学与正常小鼠相似，仍表现出两步积累模式，但血液清除较慢，脾脏初始摄取较低而后续摄取较高（图1C和图2E,F）。这些结果表明，尽管Kupffer细胞在肝脏清除中起一定作用，但ApoE介导的肝细胞摄取是主导机制。
Figure 2. Time-activity curves in tissues of mice postinjection of [64Cu]Cu-mRNA-LNP. The time-activity curves in tissues of normal mice (A and B), ApoE-deficient mice (C and D), and macrophage-depleted mice (E and F) for [64Cu]Cu-mRNA-LNP. Each value represents the mean + SD (n = 3-4).
通过整合图分析，进一步量化了肝脏和脾脏对mRNA-LNPs的摄取清除率（图3）。在正常小鼠中，肝脏的第一阶段和第二阶段摄取清除率分别为0.080±0.009 mL/min和0.049±0.004 mL/min。ApoE缺陷小鼠的这两个值显著降低至0.018±0.009 mL/min和0.023±0.005 mL/min，表明ApoE对肝脏摄取的重要性。巨噬细胞耗竭小鼠的肝脏摄取清除率介于两者之间，脾脏摄取清除率则显著增加，表明存在补偿机制。
Figure 3. Integration plot analysis for the hepatic and splenic uptake of [64Cu]Cu-mRNA-LNP.
生物发光成像显示，静脉注射后，正常小鼠和巨噬细胞耗竭小鼠的全身荧光素酶信号主要位于躯干中心（肝脏和脾脏所在位置），而ApoE缺陷小鼠的信号显著降低（图4A,C）。组织成像进一步证实，肝脏和脾脏是荧光素酶表达的主要部位，且正常小鼠的肝脏表达强度远高于ApoE缺陷小鼠（图4B,D）。巨噬细胞耗竭小鼠的肝脏表达略高于正常小鼠，脾脏表达则更高，这与PET药代动力学结果一致。
Figure 4. Luciferase expression in mice postintravenous injection of [64Cu]Cu-mRNA-LNP.
肌肉注射64Cu标记的mRNA-LNPs后，注射部位保留了高放射活性，24小时后仍有约27%ID残留（图5A-C）。肝脏和脾脏的积累浓度约为3-4%ID/g，膀胱中检测到超过10%的注射放射性，表明有尿液排泄。此外，通过离体放射性生物分布测量，发现腹股沟和腘窝淋巴结中有显著的放射性积累（图5D）。生物发光成像显示，注射部位、肝脏、脾脏和淋巴结均有荧光素酶表达，其中肝脏的表达强度最高（图6A-D）。
Figure 5. PET images, time-activity curves, and radioactivity biodistribution in mice post-intramuscular injection of [64Cu]Cu-mRNA-LNP.
Figure 6. Luciferase expression in mice post-intramuscular injection of [64Cu]Cu-mRNA-LNP.
通过比较荧光素酶表达与PET测定的积累量，发现ApoE缺陷小鼠肝脏和脾脏的比值显著低于正常小鼠，而巨噬细胞耗竭小鼠的比值则较高（图7A）。这表明ApoE介导的肝细胞摄取产生的蛋白表达能力远高于巨噬细胞。肌肉注射后，肝脏的比值低于静脉注射，表明摄取机制存在差异。淋巴结的比值较高，表明抗原呈递细胞的摄取对蛋白表达有重要贡献（图7B,C）。
Figure 7. Luciferase expression/accumulation ratio in tissues of mice postinjection of [64Cu]Cu-mRNA-LNP.
