促进CAR-T转染的材料 —— 生物评价实验102
发表时间:2022-04-25 17:49 一、体外试验 一个典型的转染过程涉及3-4个步骤:货物包装,跨膜转运,细胞内释放,转运进入细胞核。货物的位置很大程度上影响它们是否能够履行其预期的功能。例如,对于基因编辑,货物必须定位在细胞核。因为对于长期稳定的基因表达和基因编辑,货物必须进入细胞核,并整合入基因组中,因此货物的定位可视化将会非常有用。另外,对于siRNA介导的基因沉默或蛋白瞬时表达,药物必须被递送进入细胞质中。荧光共聚焦显微镜是最直接的和普遍使用的评估货物定位的方法。货物通常用荧光染料染色,细胞核用DAPI染色,从而可视化荧光信号的共定位。可以通过一些方法改善货物在细胞核的定位,如使用细胞核定位信号和微管相关序列。 在转染过程中,T细胞可能会经历不同程度的扰动,进而影响它们的关键生理特性,如基因表达。评估细胞扰动有以下几种方式。钙离子调节不同的细胞功能,作为第二信使参与多种细胞通路活动。细胞质中的钙离子水平通常维持在100*10-9M,远低于在内质网和线粒体及细胞外环境的钙离子水平(两者分别在µM和mM范围)。细胞内荧光钙水平的持续增加是细胞压力的表现,可能会引起应激反应相关的信号通路。在转染过程中,货物通过机械穿孔或电流渗透的方式被引入细胞。这些过程在细胞膜上形成了孔道,钙离子将会顺着浓度梯度进入细胞质中。细胞内钙浓度的水平的增加和高水平的持续时间是膜孔恢复稳态所需时间的指标。一种定量评估钙压力的方法是使用荧光指示剂,如Fura-2,Indo-1和Fluo-4,并计算荧光扣除背景荧光之后的变化。另一种观测细胞内钙水平的方法是通过使用基因编码的荧光蛋白,如基因编码的钙指示剂(GCaMP)。相比化学指示剂,基因编码的荧光蛋白不会造成细胞毒性,更适合长期观测,但挑战是质粒构造必须被优化以确保蛋白可以稳定表达。 稳健的T细胞激活是细胞快速扩增的先决条件。T细胞早期激活标志物CD69可用于确定是否该生物特性被转染影响。活化后,T细胞分泌一系列的效应细胞因子,如IL-2,TNF-α,IFN-γ(可以通过ELISA试验检测)。另一个更复杂的方法,多参数细胞因子染色不仅可以用于测定细胞因子的产生,还可以测定特定细胞亚型的功能标记分子。但该实验方法的缺点是灵敏度低,需要大量的实验方案优化。 抗原特异性的T细胞可以增强疗效和确保安全性。MHC多聚体技术可以用于测量修饰后的CAR受体/T细胞受体(TCR)和递呈在MHC分子表面的特定肿瘤抗原之间传导的免疫信号。这种单细胞试验使用多种MHC-I或MHC-II分子亚基(二聚体到八聚体)分别验证与表达CAR的CD8+或CD4+TCR之间的免疫作用。最常用的四聚体技术是将四个生物素化肽-MHC糖蛋白链与链酶亲和素主链连接在一起。 实体瘤对于CAR-T疗法仍然是一个巨大的挑战,一个挑战是CAR-T细胞的肿瘤浸润性差。T细胞能够响应生物分子迁移,而T细胞的迁移是一个非常重要的考量,因为T细胞对化学引诱剂的敏感性和迁移能力影响它们的效力,尤其是对实体瘤的效力。如果T细胞可以在实体瘤里迁移更快更均一,将可能实现更好的临床效果。Transwell试验是评价细胞迁移的常用方法,该方法使用一个填充了两种介质的小室,一种介质是趋化因子如IP-10,另一种是结合了CXCR3受体的化学引诱剂,通过多种膜分开两种介质。T细胞培养在小室上层,一旦感知到趋化因子的化学梯度,将会迁移到小室下层。培养一段时间后,上层小室被移开,迁移到膜上的细胞数量可以在显微镜下通过血球计数确定。膜孔的大小需要谨慎选择,避免细胞的非特异性转移。如果使用了荧光标记的T细胞,可以通过荧光显微镜观察随时间变化的迁移行为。 T细胞通过分泌细胞毒性颗粒移除肿瘤。因此评估转染后CD8+ CAR-T细胞的细胞毒功能是非常重要的。该实验可以通过混合细胞膜染料(如PKH-26或红色荧光蛋白)标记的肿瘤细胞和表达生物荧光或荧光蛋白的CAR-T细胞,共孵育一段时间后,通过流式细胞术评估细胞的体外杀伤能力,肿瘤细胞计数,和CAR-T细胞繁殖能力。CAR-T细胞和肿瘤细胞的微流控共培养可以用于该实验。 二、体内试验 1. T细胞增殖 CAR-T细胞必须浸润实体瘤,并释放细胞毒性颗粒或效应细胞因子才能发挥作用。肿瘤浸润细胞的数量多和空间分布均一是一个良好的预后生物标记。将肿瘤组织切片,在胶原酶中消化,通过过滤肿瘤悬浮液可以得到单分散的肿瘤浸润T细胞。被过滤的细胞通过荧光抗体如抗-CD4抗体、抗-CD8抗体,进行染色,使用流式细胞术可以检测CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒T细胞的比例。进一步检测T细胞在肿瘤中的分布,可以将肿瘤组织切薄片,并用荧光抗体进行染色,使用共聚焦成像观测肿瘤浸润细胞在肿瘤组织和细胞外间质中的分布。然而,显微镜的穿透力限制可能意味着更深区域的浸润细胞难以检测。Boissonnas等提议使用双光子活体镜检和免疫荧光可以检测肿瘤外周和深层区域的T细胞。空间转录组学等新兴技术也可以帮助提供肿瘤组织中新的免疫细胞和癌细胞类型的空间图。 成功的CAR-T疗法必须抑制肿瘤成长,增加存活率。使用注射了肿瘤细胞或病人来源的移植瘤动物模型可以评估CAR-T细胞的体内肿瘤抑制效果。肿瘤大小可以通过非侵入性的CAR-T体内成像,或荧光/生物发光标记的癌细胞来确定。在动物被处死之前,通常会观察肿瘤生长的进展。之后,肿瘤从动物体内移出,称重,用卡尺测量大小。肿瘤组织也可以通过TUNEL染色,激光共聚焦显微镜观测凋亡癌细胞的数量。 虽然CAR-T疗法是治疗癌症的很有前景的疗法,但它可能会造成严重的副作用和毒性。由于CAR蛋白在健康细胞中的低表达水平,临床和临床前试验中报道的导致健康组织损伤的靶向/非肿瘤毒性是主要的副作用。安全性评价可以通过两种方式评估。第一种是测定血液中细胞因子的水平。主要的细胞因子是IL-6,它与细胞因子释放综合征和神经毒性有关。第二种是检测CAR-T细胞在健康组织中的浸润。动物处死后,获取肾脏和肝脏,这些组织使用苏木精/伊红染色,其他的抗体用于检测CAR-T的浸润和器官损伤。 转染后CAR-T细胞的生物学评估试验 三、展望 过去20年,各种各样的转染技术被开发。病毒载体和大面积电穿孔被用于产生FDA批准的CAR-T产品。微纳米技术的进展也期待可以加速转染方法的发展。为了增强在临床转化的作用,需要细胞内递送的技术克服这些挑战。 首先,载体必须可以运送更大和更复杂的货物,甚至可以在不同的环境下,高特异性地同时递送多种货物。 其次,随着CAR-T疗法地流行,高通量细胞转染地需求将不可避免地增加,尤其是对于自体CAR-T产品。 第三,随着特定肿瘤和免疫细胞类型及它们在肿瘤免疫治疗中的相互作用的相关单细胞测序数据的增加,优化转染条件对于提高通量和降低成本是必须的。 最后,随着CAR-T产品需求增加的预期,重要的是可以实现按GMP认证的方式进行转染技术的放大。 往期回顾: mRNA疫苗相关文章: 1、多种疫苗对新冠病毒Lambda变异株的免疫有效性考察,斯微生物的疫苗表现较为良好 CAR-T转染相关文章: 1、用于CAR-T转染的材料——前言 CRISPR-Cas9相关文章:1、抑制Cas9在肝脏的活性,可提高基因编辑在肺脾的靶向性 |