图1：(A)降解速率常数和温度的相关性。(B)不同温度mRNA的半衰期
mRNA分子在自然界中是一种内在不稳定的分子，特别是在水溶液中。mRNA的不稳定性主要来源于两个方面：化学降解和物理不稳定。化学降解主要包括水解和氧化，其中水解是mRNA降解的主要机制。物理不稳定则包括二级或三级结构的丧失、聚集和沉淀。这些不稳定因素不仅影响RNA的生物活性，还限制了其在生物技术领域的应用。
1.1 化学降解
mRNA的水解主要发生在磷酸二酯键上，通过核糖的2'-OH基团对磷酸二酯键的亲核攻击进行。这一过程可以由核酸酶催化，也可以由水分子、Bronsted酸碱或二价阳离子等非酶促方式引发。无论是单链还是双链RNA，其磷酸二酯键在序列的任何位置都有可能发生水解。
1.2 物理不稳定
mRNA的物理不稳定主要包括二级和三级结构的丧失，这会导致mRNA的功能丧失。高度结构化的mRNA能够增加其稳定性，从而延长其在体内的翻译时间。此外，mRNA的聚集和沉淀也是物理不稳定的重要表现。
图2：mRNA在不同温度条件下第0天（图A）和储藏4天后（图B）的圆二色谱图
2.1 温度
温度是影响mRNA稳定性的关键因素之一。随着温度的升高，mRNA的降解速率显著增加。研究表明，mRNA的降解速率与温度之间遵循Arrhenius方程，即降解速率常数与温度的倒数呈线性关系。这意味着在较低温度下，mRNA的稳定性更高。
在实验中，研究人员通过在不同温度下储存mRNA并监测其降解情况，发现mRNA的完整性随时间的延长而降低。特别是在高温条件下，mRNA的降解速率显著加快。因此，在mRNA的储存和运输过程中，保持低温是至关重要的。
图3：温度对不同序列长度mRNA完整性的影响
2.2 mRNA长度
mRNA的长度与其稳定性呈负相关关系。随着mRNA长度的增加，其降解位点也随之增多，从而导致稳定性下降。这一结论在多项研究中得到了验证。例如，在一项针对不同长度mRNA稳定性的研究中发现，随着mRNA长度的增加，其降解速率常数也相应增加。
此外，mRNA的5'帽结构和3'多聚A尾对其稳定性也有重要影响。5'帽结构是mRNA翻译和蛋白质生产的重要识别位点，其完整性对mRNA的稳定性至关重要。而3'多聚A尾的缩短则会导致mRNA降解速率加快。
图4：不同温度不同序列长度mRNA的降解速率（A）和半衰期（B）
2.3 缓冲剂种类
缓冲剂种类对mRNA的稳定性也有重要影响。不同缓冲剂具有不同的化学性质和缓冲能力，因此对mRNA的稳定作用也不同。例如，柠檬酸缓冲剂因其螯合能力而有助于稳定mRNA的磷酸二酯骨架。而HEPES和Tris缓冲剂则因其良好的缓冲性能和稳定性而被广泛应用于mRNA的储存和运输中。
图5：不同缓冲液种类和pH对mRNA稳定性的影响
2.4 pH值
溶液的pH值对mRNA的稳定性也有显著影响。不同pH条件下，mRNA的降解速率和稳定性表现出明显差异。一般来说，在中性pH条件下（如pH 7.0），mRNA的稳定性较高。而在酸性或碱性条件下，RNA的降解速率会显著增加。
此外，不同缓冲剂对mRNA稳定性的影响也不同。例如，在柠檬酸缓冲液中，mRNA在pH 3.0和4.0条件下极易降解，而在pH 6.0条件下稳定性最佳。而在HEPES和Tris缓冲液中，pH 7.0则提供了最佳的稳定性。
图6：不同缓冲液种类和pH对mRNA热学性质的影响
2.5 浓度
mRNA在溶液中的浓度也会影响其稳定性。研究表明，随着mRNA浓度的增加，其降解速率呈现非线性下降趋势。这可能是因为高浓度的mRNA分子之间形成了自我保护效应，从而减缓了降解过程。然而，当mRNA浓度过高时，可能会引发其他不利因素，如聚集和沉淀。
3.1 低温储存
为了保持mRNA的稳定性，应尽可能在低温条件下储存mRNA。在实验室中，通常将mRNA储存在-20°C或更低的温度下。对于需要长期储存的mRNA样品，可以考虑使用液氮进行超低温储存。
3.2 优化pH值和缓冲剂
选择合适的pH值和缓冲剂对于提高mRNA的稳定性至关重要。在储存和运输mRNA时，应根据具体情况选择合适的缓冲剂和pH值条件。例如，在柠檬酸缓冲液中储存mRNA时，应确保pH值在6.0左右以获得最佳稳定性。
3.3 控制mRNA浓度
在储存和运输mRNA时，应控制其浓度在适当范围内，如适当提高mRNA浓度有利于mRNA的稳定性。
参考文献
Chheda, Urmi, et al. "Factors affecting stability of RNA–temperature, length, concentration, pH, and buffering species." Journal of Pharmaceutical Sciences 113.2 (2024): 377-385.
